黃芪多糖對肺纖維化大鼠mTOR、p-S6、α-SMA的影響

杜全宇，柳麗娟，朱萬婷，李 莎，張月琳

(德陽廣播電視大學，四川德陽 618000)

彌漫性肺間質纖維化根據病因不同可分為繼發性和特發性[1]，特發性肺纖維化原因不明，發病機制復雜，缺乏有效治療手段，預后較差[2]。目前的研究認為，肺纖維化的主要發病機制與肺泡損傷后的異常修復導致肺內成纖維細胞灶形成密切相關。肌成纖維細胞是成纖維細胞的活化形式，表達α-平滑肌肌動蛋白(Alpha-Smooth Muscle Action，α-SMA)是其特點，通過阻斷哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是阻斷α-SMA合成的途徑之一[3]。mTOR信號通路被認為是調節細胞存活、生長、增殖、轉分化的中心樞紐[4]。最近的研究顯示，mTOR作為一種重要的信號通路途徑參與了纖維化疾病的發病，與纖維化病理變化的核心環節肌成纖維細胞的過度增殖有關[5]。在祖國醫學中肺纖維化為本虛標實之證，其病機復雜，病位在肺[6]，在臨床上使用益氣活血法進行治療可較好改善患者癥狀及生存質量[7]。本研究選用益氣固表中藥黃芪的主要有效成分黃芪多糖為實驗藥物，以博萊霉素氣管注入致大鼠發生肺纖維化，以mTOR阻斷劑雷帕霉素為對照，探尋黃芪多糖和mTOR信號通路在肺纖維化疾病發展中的作用及機制。

1 材料

1.1儀器

2015型轉輪式切片機(德國Leica儀器有限公司)；TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機、BMJ-Ⅲ型包埋機、PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器有限公司)；BA400Digital數碼三目攝像顯微鏡(廈門麥克奧迪實業集團有限公司)；Zj-003臺式高速離心機(安徽科大中佳公司)；Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(美國Media Cybernetics公司)。

1.2 藥物及試劑

多聚甲醛(天津市進豐化工有限公司，批號：20150813)；硫酸博萊霉素、雷帕霉素、黃芪多糖，純度>68%(大連美侖生物，批號：M0401A、J0102A、A0418A)；無水乙醇、二甲苯、麗春紅(成都科龍化工試劑廠，批號：20150619、20150918、20150915)；甲苯胺藍(上海如吉生物科技發展有限公司，批號：120418)；蘇木素(北京百靈威科技有限公司，批號：LM10N13)；一抗α-SMA、磷酸化S6核糖體蛋白(phospho-S6 ribosomal protein，p-S6)、mTOR(英國Abcam艾博抗(上海)貿易有限公司，批號：ab5694、ab131470、ab32028)；生物素化山羊抗兔IgG(北京中山金橋生物有限公司，批號：13152A11)；辣根酶標記鏈霉素卵蛋白素、山羊血清、濃縮型DAB試劑盒、PBS磷酸鹽緩沖液(北京中衫金橋生物有限公司，批號：13152A11、13152A12、K135925C、ZLI-9062)。

1.3 實驗動物

雄性SPF級SD大鼠，48只，體質量(220±20)g，購于成都達碩實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK(川)2015-24。

2 方法

2.1動物分組及給藥

將所有SD大鼠適應性喂養1周后進行實驗，隨機分為6組，每組8只，分別為空白對照組(Con)，博萊霉素模型組(BLM)，黃芪多糖(APS)高、中、低劑量組，雷帕霉素對照組(RAPA)。除空白對照組外，其余各組均參照文獻[8]采用氣管內注射博萊霉素的方法復制肺纖維化模型，空白對照組氣管內注入等量生理鹽水。于造模第2天開始灌胃給藥，其中Con組和BLM組給予生理鹽水10 mL·kg-1，APS高、中、低劑量組分別給予黃芪多糖800、400、200 mg·kg-1，RAPA組給予雷帕霉素0.5mg·kg-1，連續給藥28 d。

2.2 一般情況觀察

造模前對所有大鼠進行詳細觀察，實驗過程中監測各組大鼠飲食、飲水、體質量、皮毛、呼吸及對外界刺激的反應情況，每周稱體質量1次。

2.3 病理學形態檢查

各組動物麻醉后立即開胸取肺組織，生理鹽水沖洗干凈后使用4%多聚甲醛固定，常規脫水石蠟包埋、切片，進行蘇木素-伊紅(HE)染色、馬松(Masson)染色，光學顯微鏡下觀察結果。

2.4 免疫組化檢查

切片常規脫蠟至水，滅活內源性過氧化物酶，熱修復抗原后滴加山羊血清封閉液，室溫20 min；滴加一抗(1∶200)，4 ℃過夜，PBS洗3次；滴加生物素化山羊抗兔IgG二抗，37 ℃作用30 min，PBS清洗3次；滴加辣根過氧化酶標記鏈霉素卵蛋白試劑，37 ℃作用30 min，PBS清洗4次；DAB顯色；蘇木素輕度復染、脫水、透明、中性樹膠封片。

2.5 統計分析

3 結果

3.1 對大鼠一般情況的影響

實驗期間BLM組大鼠死亡2只，死亡原因可能與造模引起的損傷、實驗動物的耐受性和藥物的毒性有關。Con組大鼠攝食飲水良好，反應靈敏，呼吸平穩，毛色光澤，體重逐步增加；BLM模型組大鼠在實驗過程中出現精神萎靡，動作遲緩，喜歡扎堆蜷縮，皮毛光澤減退，呼吸急促，攝食飲水量下降，體重增加緩慢；APS各組和RAPA組大鼠精神較好，反應迅速，毛色光澤度較好，呼吸平穩，體重逐步增加。

3.2 對大鼠肺組織病理學的影響

在肺組織大體形態上，Con組大鼠雙肺濕潤，呈粉紅色，表面光滑，邊緣銳利，質地柔軟，無瘀點瘀斑，無充血水腫。BLM模型組大鼠雙肺顏色變暗，彈性下降，表面粗糙不平，部分肺葉可見灰白色、暗紫色結節和肺葉萎縮，部分肺葉質地較硬，與胸腔內其它組織粘連。APS各組大鼠肺組織呈粉紅色，表面較光滑，偶見瘀點，無明顯充血水腫。RAPA組大鼠肺組織顏色稍暗，表面光滑，無瘀點瘀斑，偶見粘連。

HE染色光鏡下見Con組大部分樣本肺組織結構清晰，無充血水腫。BLM模型組有較多炎癥細胞和成纖維細胞，肺泡間隔增厚，肺泡基本結構破壞，以纖維化改變為主。APS各組肺組織結構較清楚，偶見肺間質增寬、炎性細胞浸潤、支氣管上皮細胞水腫和多個肺泡融合。RAPA組大鼠肺組織結構破壞較APS組明顯，可見炎性細胞、肺泡壁斷裂和細胞水腫。參照Szapiel等的4級分級標準判定肺泡炎程度，由表1和圖1可見，BLM模型組肺泡炎積分升高，與Con組比較，P<0.01，APS高、中、低劑量組及RAPA組肺泡炎積分較BLM模型組降低，P<0.01。

Masson染色可見空白對照組大鼠肺組織無明顯纖維化改變。BLM模型組在支氣管壁、血管外壁和增厚的肺泡隔內可見較多膠原纖維。APS各組和RAPA組大鼠肺組織中藍色膠原纖維較BLM組減少。參照Szapiel等的4級分級標準判定肺纖維化程度，由表2和圖2可見，BLM模型組與空白組比較，大鼠肺組織纖維化積分明顯升高，具有顯著性差異，P<0.01。APS高、中、低劑量組和RAPA組與BLM模型組比較，大鼠肺組織纖維化積分明顯降低，P<0.01。

表1 黃芪多糖對大鼠肺泡炎積分的影響

注：與空白對照組比，1)P<0.01；與BLM模型對照組比，2)P<0.01。

表2 黃芪多糖對Masson染色后大鼠肺纖維化積分的影響

注：與空白對照組比，1)P<0.01；與BLM模型對照組比，2)P<0.01。

圖1 各組大鼠肺組織HE染色結果

圖2 各組大鼠肺組織MASSON染色結果

3.3 對大鼠肺組織中P-S6、α-SMA、mTOR表達的影響

由表3和圖3-圖5可見，BLM模型組大鼠肺組織中p-S6、α-SMA、mTOR的平均光密度較空白對照組明顯升高，P<0.01。APS各組、RAPA組與BLM模型組比較，大鼠肺組織中p-S6、α-SMA、mTOR平均光密度降低，P<0.01。

表3 黃芪多糖對大鼠肺組織中p-S6、α-SMA、mTOR表達的影響

注：與空白對照組比，1)P<0.01；與BLM模型對照組比，2)P<0.01。

圖3 各組大鼠肺組織中p-S6觀察結果

圖4 各組大鼠肺組織中α-SMA觀察結果

圖5 各組大鼠肺組織中mTOR觀察結果

4 討論

肺纖維化后期的病理特點為成纖維細胞病理性增殖轉型為肌成纖維細胞和細胞外基質進行性異常積聚并取代正常的肺組織結構[9]。表達α-SMA是肌成纖維細胞的特征[10]，α-SMA的異常激活在肺纖維化的分子病理機制中占有極重要的地位[11]。目前的研究顯示[12]，可能阻斷α-SMA合成的途徑主要有三個方面：使用松弛素B、Rho激酶抑制劑和阻斷mTOR。mTOR是PI3K/Akt信號通路下游的效應蛋白，與纖維化疾病的核心環節，肌成纖維細胞的過度增殖密切相關[13]。最近的研究顯示，肌成纖維細胞可出現mTOR信號調控異常，參與心臟纖維化[14]、肝臟纖維化[15]、肺纖維化[16]等疾病的發生。mTOR在細胞內主要參與形成mTORC1和mTORC2兩種復合物[17]，雷帕霉素是mTORC1通路的阻斷劑，使用雷帕霉素預先給藥可改善博來霉素所致小鼠肺纖維化的發生[18]。p-S6是mTOR信號通路下游重要的效應蛋白，可反映mTOR信號通路的活化情況。

在祖國醫學中肺纖維化多歸屬于 “肺痿”“肺痹”“肺脹”等疾病范疇，目前認為其主要病機與肺腎虧虛、氣虛血瘀、痰熱互結、痹阻肺絡等相關[19]。肺腎虧虛是肺纖維化發病的核心病機，其中以肺氣虛尤為關鍵，肺氣虛可引起生痰、致瘀、化熱等病機變化，而在肺纖維化的臨床治療中以益氣法為基礎，配合活血、通絡、清熱等在患者的治療中也取得了良好效果。研究顯示，包括黃芪在內的多種中藥及其有效成分均對肺纖維化有抑制作用[20]。黃芪是重要的補氣藥，黃芪多糖是黃芪藥理作用中起決定性因素的一類大分子化合物，既往研究表明，黃芪多糖對機體的體液免疫、細胞免疫以及非特異性免疫都有較好的調節功能[21]。以黃芪為君藥的益氣活血法在對肺纖維化大鼠的研究中顯示，該法能有效抑制模型大鼠TGF-β1的生成，通過調節TGF-β1/Smad通路，干預肺纖維化進程[22]。

本研究結果顯示，BLM模型組大鼠肺組織內α-SMA、p-S6和mTOR的平均光密度明顯升高，提示在博萊霉素所引起的大鼠肺纖維化過程中mTOR信號通路活化，可能是肺纖維化的重要參與機制。黃芪多糖可降低博萊霉素所引起的肺纖維化模型大鼠肺組織中p-S6、α-SMA、mTOR等蛋白的平均光密度，降低肺纖維化大鼠的肺泡炎積分和肺纖維化積分，說明黃芪多糖可能通過抑制mTOR及其下游的p-S6的表達，抑制肌成纖維細胞特征標志物α-SMA的表達，影響肺纖維化的發生發展。