TRPC1對慢性阻塞性肺疾病慢性氣道炎癥的影響

吳曉娟 賈寶林 羅曉斌 邱容 羅文 李敏超 何正光

慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)是一種復雜的氣道慢性炎癥性病變，其特點是進行性、不完全可逆性氣流受限[1]。慢阻肺發病率、致殘率及死亡率逐年升高，目前已經上升為一種全球性的健康問題[2]。在吸煙、空氣污染、感染等多種危險因素作用下，淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞導致氣道慢性炎癥反應，引起氣道平滑肌細胞、成纖維細胞增生及細胞外基質沉積，從而出現慢阻肺典型的病理特征氣道重塑[3]。瞬時受體電位通道C(transient receptor potential channel C,TRPC)是重要的細胞膜受體蛋白，在溫度、酸、光、機械力等多種化學及物理刺激后該通道激活[4]，鈣離子內流，引起下游一系列反應。TRPC1是TRPC的亞家族之一[5]，研究證明TRPC1在慢阻肺患者氣道上皮細胞呈高表達狀態[6]。故此，本研究主要探討氣道內TRPC1表達水平與慢阻肺患者慢性氣道炎癥之間的關系，并觀察吸入型激素(inhaled glucocorticoid, ICS)布地奈德對TRPC1表達水平的影響。

資料與方法

一、研究對象

收集2017年7月～2018年2月遂寧市中心醫院因肺部結節需行纖維支氣管鏡檢查的46例慢阻肺患者和32例非慢阻肺患者。慢阻肺組納入標準：符合中華醫學會呼吸病學分會2013年慢性阻塞性肺疾病診治指南的診斷標準；近1個月無急性加重且未合并肺部感染；胸部CT檢查提示肺部結節直徑≤3 cm；男女不限；年齡55～85歲。排除標準：有支氣管擴張、哮喘、肺部感染、肺結核、嚴重免疫功能低下及免疫缺陷等疾病；合并有嚴重心、肝、腎功能不全，且不能耐受支氣管鏡檢查的患者；有激素使用禁忌證者。對照組納入標準：肺通氣功能正常；胸部CT檢查顯示肺部結節直徑≤3 cm；近1個月以來未服用激素及免疫抑制劑類藥物；肺部未合并感染；男女不限；年齡55～85歲。合并有肺部感染、肺結核等基礎肺疾病及其他系統嚴重性疾病不能耐受支氣管鏡檢查者不納入對照組。

慢阻肺組患者再隨機分為ICS組(23例)及非ICS組(23例)。ICS組每日3次規律吸入布地奈德混懸液1 mg(阿斯利康制藥有限公司，規格2 mL∶1 mg)；非ICS組每日3次規律予以同等劑量安慰劑治療。治療前及治療后3個月以同樣方法行纖維支氣管鏡檢查。告知所有受試者研究目的并簽署知情同意書，該實驗通過遂寧市中心醫院倫理委員會批準后進行。

二、主要試劑

白細胞介素13(interleukin-13, IL-13)、成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor-2, FGF-2)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(武漢優爾生商貿有限公司)；兔抗人TRPC1抗體(Abcam 公司)；兔抗人GAPDH單克隆抗體和山羊抗兔IgG抗體(上海碧云天生物技術有限公司)。Trizol試劑盒(Invitrogen, CA, USA)，SYBR Premix Ex TaqTM ⅡPCR kit、PrimeScript RT reagent Kit試 劑 盒、DL2000 marker(日本TaKaRa公司)。

三、方法

1 標本的收集 完善血常規、凝血功能、心電圖、肺功能等檢查后，受試者于纖維支氣管鏡下行支氣管肺泡灌洗，回收率要求達40%～60%，灌洗液以 4 ℃ 1 500 r/min 離心10 min，上清液置于-80 ℃待檢，留取細胞沉渣涂片，吉姆薩染色法染色后于光學顯微鏡下進行細胞分類計數[7]。支氣管肺泡灌洗后在纖維支氣管鏡引導下采用防污染細胞刷(Anrei, LAMHCB-2012-2010，杭州)均于右肺中葉段或亞段支氣管處進行刷檢，刷檢后將細胞刷收回導管內，將整個細胞刷退出氣道外，刷檢標本置于-80 ℃，待檢。

2 Western Blot檢測支氣管上皮細胞中的TRPC1表達 方法按照參考文獻[8]進行，細胞裂解液提取支氣管上皮細胞總蛋白，BCA法進行蛋白定量。采用SDS-PAGE電泳將蛋白進行分離，然后轉至PVDF膜，室溫封閉1h后加入兔抗TRPC1多克隆抗體(1∶1 000)，以GAPDH(1∶1000)作為內參，4℃孵育過夜，TBST洗膜三次。采用辣根過氧化酶標記的山羊抗兔IgG二抗(1∶1 000)室溫孵育1h，TBST再次洗膜三次，ECL顯影和定影。結果采用Quantity one軟件進行分析，以與GAPDH產物的比值作為該蛋白的相對表達量。

3 qRT-PCR檢測支氣管上皮細胞TRPC1 mRNA的表達 Trizol法提取細胞總RNA。采用PrimeScript RT reagent Kit 試劑盒逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行擴增。擴增體系：SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ 12.5μL，引物1μL,cDNA 2 μL,ddH2O 8.5 μL。TRPC1引物序列：上游5′-GAAGATTTTGGGAAATTTCTGG-3′，下游5′-CTTATCCTCATGTTTGCTAT-3′。GAPDH引物序列：上游5′-AATCCCATCATCACCATCTTCCA-3′；下游5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTGAGG-3′。反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性15 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min；共進行35個循環，最后在72 ℃條件下延伸10 min。光密度(OD)分析采用Image J軟件，與GAPDH比值作為目的基因的相對表達量。

4 BALF中炎癥介質IL-13、FGF-2的檢測 ELISA法檢測BALF上清液IL-13和FGF-2濃度，操作方法按試劑盒說明進行。

四、統計學方法

結 果

一、受試者年齡、吸煙史及肺功能等臨床特征比較

對照組和慢阻肺組的年齡、吸煙指數、性別比較，無統計學意義，具有可比性。而肺功能檢查結果顯示，與對照組相比較，慢阻肺組患者的第一秒用力呼氣容積/用力肺活量(FEV1/FVC%)、FEV1占預計值百分比(FEV1/Pre%)、第一秒用力呼氣容積(FEV1)、用力肺活量(FVC)均顯著降低，差異具有統計學意義。ICS組和Non-ICS組在年齡、吸煙史、性別及肺功能FEV1/FVC%、FEV1/Pre%、FEV1、FVC方面相比，差異無統計學意義，具有可比性(見表1，2)。

二、TRPC1蛋白在支氣管上皮細胞中的表達水平

Western Blot檢測結果表明，相比于對照組，慢阻肺組支氣管上皮細胞TRPC1蛋白表達水平明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.01)；同時，使用布地奈德后TRPC1表達量下降，ICS組支氣管上皮細胞的TRPC1蛋白表達水平低于非ICS組，差異具有統計學意義(P<0.05)(圖1～3)。

三、qRT-PCR測定TRPC1mRNA在支氣管上皮細胞中的表達情況

表1 對照組和慢阻肺組受試者各特點比較

注：*P<0.05，**P<0.01

表2 ICS組和Non-ICS組臨床特點比較

注：均P>0.05

圖1 Western blot檢測各組支氣管上皮細胞的TRPC1蛋白表達水平

圖2 對照組和慢阻肺組中的TRPC1蛋白相對表達量

圖3 ICS組和非ICS組中的TRPC1蛋白相對表達量

qRT-PCR結果顯示，慢阻肺組和對照組TRPC1mRNA表達量分別為(1.30±0.99)、(0.29±0.15)，慢阻肺組支氣管上皮細胞中的TRPC1mRNA表達水平顯著高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)(圖4)；而非ICS組和ICS組TRPC1mRNA表達量為(1.78±1.29)、(0.91±0.59)，未吸入ICS的患者與吸入ICS的患者相比，支氣管上皮細胞中的TRPC1mRNA表達量明顯增加(P<0.05)(見圖5)。

圖4 qRT-PCR法測定對照組和慢阻肺組支氣管上皮細胞內的TRPC1mRNA表達水平

圖5 qRT-PCR法測定ICS組和非ICS組支氣管上皮細胞內的TRPC1mRNA表達水平

四、支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluids, BALF)中的細胞學分類計數

如表2所示，與對照組相比，慢阻肺組BALF中的中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞數增多，差異具有統計學意義(P<0.05)，但是兩組BALF中的嗜酸性細胞計數相互比較則無明顯差異性(P>0.05)(表2)。長期規律使用ICS的慢阻肺患者BALF中的中性粒細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞數較未使用ICS的慢阻肺患者均降低(P<0.05)(見表3)。

表2 對照組和慢阻肺組BALF中的細胞學分類計數

注：**P<0.01

表3 ICS組和非ICS組 BALF中的細胞學分類計數

注：*P<0.05,**P<0.01

五、ELISA法檢測 BALF中的FGF-2, IL-13表達水平

慢阻肺組BALF中的炎性因子FGF-2, IL-13表達水平顯著高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.01)(表4)。相比于非ICS組，ICS組BALF中的FGF-2, IL-13表達量明顯降低(P<0.05)(見表5)。

表4 對照組和慢阻肺組BALF中的FGF-2, IL-13表達水平

注：**P<0.01

表5 ICS組和非ICS組BALF中的FGF-2, IL-13表達水平

注：*P<0.05

六、相關性分析

相關性分析結果顯示，TRPC1mRNA及蛋白表達水平均與FEV1/Pre%呈負相關關系(r=-0.505,r=-0.443,P<0.01)；而TRPC1蛋白表達水平與BALF中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞數呈正相關關系(r分別為0.401，0.530，0.451，P<0.05)，TRPC1mRNA表達水平與BALF中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞數也呈正相關關系(r分別為0.551，0.539，0.378，P<0.05)。同時，發現支氣管上皮細胞的TRPC1蛋白表達水平與BALF中的IL-13、FGF-2濃度之間呈正相關關系(r分別為0.373，0.318，P<0.05)，TRPC1mRNA表達水平與BALF中IL-13、FGF-2濃度同樣呈正相關關系(r分別為0.422，0.327，P<0.05)。

討 論

慢性阻塞性肺疾病是一種復雜的慢性氣道炎癥性疾病，在多種炎性細胞及炎性介質的反復刺激下，支氣管上皮細胞增生、鱗狀細胞和杯狀細胞化生、膠原蛋白沉積、基質纖維化及小血管生成，導致氣道重塑，從而使得該類患者出現不完全可逆性氣流受限。本研究結果發現，慢阻肺患者的TRPC1通道蛋白水平及mRNA表達量均顯著高于正常人，該實驗結果與Xu 等[9]的結果相符。近幾年發現，TRPC1是哺乳動物細胞的一種新型Ca2+通道[10]，在各種物理、化學等因素刺激下，該通道打開，胞內第二信使Ca2+內流增加，通過TRPC1-Ca2+-PKC信號途徑上調炎性因子FGF-2、MMP-9、TGF-β1、IL-13等的生成，促進氣道重塑[11-12]，故我們認為TRPC1在慢阻肺氣道重塑過程中起重要作用。

TRPC1除了在中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞中表達外，還誘導中性粒細胞遷移及趨化，在炎癥反應過程中起重要作用[13]。同時，我們的實驗證明，慢阻肺患者BALF中的巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞數及炎癥介質IL-13、FGF-2 水平明顯高于正常人，相關性分析結果顯示，TRPC1表達水平與BALF的中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞數及IL-13、FGF-2濃度呈正相關關系，而TRPC1表達量與肺功能FEV1/Pre之間呈負相關關系。Eda Yildirim等的實驗也發現，TRPC1-/-組小鼠比TRPC1+/+組BALF中的淋巴細胞、巨噬細胞等細胞數顯著減少[14]。由于慢阻肺患者氣道內TRPC1呈高表達狀態，因此，我們認為TRPC1激活后，胞內Ca2+內流，通過TRPC1-Ca2+-PKC信號通路提高巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞數及炎性因子的表達水平從而促進氣道慢性炎癥反應，加重慢阻肺疾病的發展。我們的實驗首次發現，TRPC1可能通過參與慢性氣道炎性反應過程，出現慢阻肺典型的病理變化特征氣道重塑，導致慢阻肺患者氣流受限不完全可逆、急性發作次數增加及肺功能的進行性下降。

前期的動物實驗證實，TRPC1與氣道慢性炎癥及氣道重塑密切相關，而吸入型激素布地奈德在一定程度上可通過下調TRPC1的表達干預氣道重塑過程[15]，本研究發現，規律使用ICS的慢阻肺患者氣道上皮細胞TRPC1表達量和BALF中的巨噬細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞數及炎癥介質IL-13、FGF-2 水平顯著低于未使用ICS的慢阻肺患者，故此，我們推測ICS可能通過干預TRPC1的表達及炎性細胞和炎癥介質的合成，從而減輕慢阻肺患者氣道慢性炎癥反應過程，改善患者肺功能。

綜上所述，本研究證實，TRPC1通道在可能通過參與慢阻肺氣道炎性細胞及炎癥介質的合成從而在慢性氣道炎癥反應過程中起重要作用，而ICS在一定程度上可能通過下調該作用減緩氣道炎癥反應過程，減輕慢阻肺疾病的發生、發展。