IL-8及SPB蛋白在兔海水及淡水淹溺型急性肺損傷模型中的表達(dá)

喬永平 劉軼寧

淹溺型急性肺損傷指因海水或淡水淹溺，液體經(jīng)口鼻進(jìn)入肺泡組織，導(dǎo)致廣泛肺組織水腫，肺通氣量短時(shí)間內(nèi)下降，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)呼吸功能障礙，嚴(yán)重患者可在短時(shí)內(nèi)腦死亡[1-2]。海水，淡水因溶質(zhì)成分、理化性質(zhì)差異，引起急性肺損傷的機(jī)制通路有所不同，但兩者進(jìn)入肺組織后除直接損失作用外，均引發(fā)肺組織廣泛炎癥因子分泌增多，炎癥反應(yīng)發(fā)生，同時(shí)可致低氧血癥，酸中毒等并發(fā)癥發(fā)生，故臨床認(rèn)為淹溺型急性肺損傷患者損傷機(jī)制與炎癥發(fā)生有直接關(guān)聯(lián)[3-4]。IL-8屬于細(xì)胞白介素家族成員，是一種細(xì)胞炎癥因子，通常由干擾素α(TNF-α)調(diào)節(jié)其分泌激活過(guò)程，其具有促進(jìn)白細(xì)胞趨化，粘附的作用，是炎癥反應(yīng)啟動(dòng)的重要因子[5]。馮繼峰等人在研究中證實(shí)其在機(jī)械性急性肺損傷中分泌可增加，對(duì)肺組織炎癥發(fā)生有直接關(guān)聯(lián)[6]。SPB是一種屬于表面活性蛋白家族，是肺表面活性成分的主要組成部分，具有穩(wěn)定肺泡膜表面磷脂單分子層的作用，能有效降低表面張力維持肺泡結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；部分研究還認(rèn)為SPB能在低氧情況下保護(hù)肺組織[7-8]。研究認(rèn)為急性肺損傷發(fā)生過(guò)程中，因肺水腫、肺廣泛炎癥反應(yīng)作用，肺泡磷脂単分子層受到破壞，炎癥反應(yīng)可影響SPB分子活性加重肺損傷[9]。本研究擬探究IL-8與SPB蛋白在淹溺型肺損傷中的表達(dá)情況，試探究其在淹溺型肺損傷中的表達(dá)意義。

資料與方法

一、一般資料

取由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)健康成年新西蘭兔36只，采用隨機(jī)數(shù)表分組，將其分海水組，淡水組與對(duì)照組，各組實(shí)驗(yàn)兔為雌、雄各6只。三組兔均在SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)一周后行麻醉下氣管插管，氣管插管完成后，海水組兔經(jīng)氣管插管向氣管內(nèi)注射3 mL/kg配置海水，淡水組經(jīng)氣管插管向氣管內(nèi)注射18 mL/kg配置淡水，對(duì)照組兔僅行麻醉氣管插管操作。手術(shù)操作完成后，持續(xù)插管通氣4h，通氣結(jié)束后處死各組實(shí)驗(yàn)兔，收集肺組織。三組實(shí)驗(yàn)兔體重，年齡等一般資料數(shù)據(jù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05(見表1)。本研究已經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審核并通過(guò)。

表1 三組實(shí)驗(yàn)兔基線指標(biāo)對(duì)比

二、干預(yù)方法

取于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心養(yǎng)殖健康成年新西蘭兔36只，采用隨機(jī)數(shù)表分組，將其分海水組，淡水組與對(duì)照組。選擇入組后均在SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)房中飼養(yǎng)一周，于手術(shù)前一天禁食禁水。手術(shù)過(guò)程：取實(shí)驗(yàn)兔，耳緣靜脈完成靜脈置管后，予戊巴比妥鈉30 mg/kg緩慢推注，待動(dòng)物疼痛反射消失后取其置于操作架上，經(jīng)口插入氣管導(dǎo)管，調(diào)整呼吸機(jī)參數(shù)維持呼吸頻率20～30次/分。取購(gòu)置于第三海洋研究所，按我國(guó)東部沿海地區(qū)海水成分配置的人工海水，以3 mL/kg標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)氣管導(dǎo)管注入海水組實(shí)驗(yàn)兔肺內(nèi)；取取自本地符合水質(zhì)三級(jí)標(biāo)準(zhǔn)淡水，以18 mL/kg標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)氣管導(dǎo)管注入淡水組實(shí)驗(yàn)兔肺內(nèi)。對(duì)照組實(shí)驗(yàn)兔僅行麻醉插管操作。完成操作后于耳緣靜脈注射50 mL空氣，處死實(shí)驗(yàn)兔。

三、觀察指標(biāo)

1 比較三組實(shí)驗(yàn)兔肺組織干濕重比：取處死實(shí)驗(yàn)兔肺組織直接稱重，稱取肺組織濕質(zhì)量，后將肺組織置于烘箱內(nèi)，設(shè)置烘箱參數(shù)80℃，持續(xù)烘干肺組織72 h后取出，稱取烘干后肺組織質(zhì)量，為肺組織干質(zhì)量，比較三組實(shí)驗(yàn)兔肺組織兩次稱重比值大小。

2 比較三組實(shí)驗(yàn)兔肺泡灌注液中IL-8及SPB蛋白水平：取處死實(shí)驗(yàn)兔左上肺組織，以10 mL生理鹽水經(jīng)支氣管灌洗肺組織，回收灌洗液，后靜置回收液，置入離心機(jī)3000r離心后，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定灌洗液中IL-8及SPB蛋白表達(dá)情況。檢測(cè)試劑盒購(gòu)于R&D公司，具體操作按說(shuō)明書進(jìn)行。

3 比較三組實(shí)驗(yàn)兔肺組織IL-8及SPB蛋白表達(dá)情況：取處死實(shí)驗(yàn)兔左上肺組織，研磨后加入蛋白裂解液，置入離心機(jī)3000r離心后，取上清液加入40μg總蛋白，行凝膠電泳，將結(jié)果轉(zhuǎn)移至含有IL-8及SPB蛋白抗體的PVDF膜上，加入洗脫液洗膜后室溫下孵育1～2 h，使用Western bolt檢測(cè)肺組織內(nèi)IL-8及SPB蛋白表達(dá)情況，試劑盒采購(gòu)于自碧云天生物技術(shù)研究所。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、三組實(shí)驗(yàn)兔肺組織干濕重比對(duì)比情況

海水組與淡水組W/D較對(duì)照組均明顯上升，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且兩組兔肺組織W/D無(wú)明顯差異(P>0.05)(見表2)。

表2 三組實(shí)驗(yàn)兔肺組織干濕重比(W/D)

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05,與海水組相比，兩組無(wú)明顯差異，#P>0.05

二、三組實(shí)驗(yàn)兔肺泡灌洗液IL-8及SPB蛋白水平

海水組與淡水組肺泡灌洗液中IL-8水平較對(duì)照組表達(dá)均上升，SPB蛋白較對(duì)照組明顯下降，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且兩組兔肺泡灌洗液中IL-8及SPB蛋白水平無(wú)明顯差異(P>0.05)(見表3)。

表3 三組實(shí)驗(yàn)兔肺泡灌洗液IL-8及SPB蛋白表達(dá)情況

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05,與海水組相比，兩組無(wú)明顯差異，#P>0.05

三、三組實(shí)驗(yàn)兔肺組織IL-8及SPB蛋白表達(dá)情況

海水組與淡水組肺組織中IL-8水平較對(duì)照組表達(dá)均上升，SPB水平較對(duì)照組明顯下降，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且兩組兔肺組織中IL-8及SPB蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)(見圖1)。

圖1 三組實(shí)驗(yàn)兔肺組織IL-8及SPB蛋白表達(dá)

討 論

淹溺死亡是常見的死亡因素，近年來(lái)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示，淹溺型急性肺損傷所致死亡事件以上升至各意外死亡事件中第二位，特別對(duì)于兒童患者，淹溺所致急性肺部損傷已成為兒童意外死亡主要原因之一，兒童因低氧耐受時(shí)間短，肺泡組織發(fā)育不完全等因素，導(dǎo)致兒童淹溺型急性肺損傷發(fā)生速度快，癥狀更嚴(yán)重，死亡率更高，故該病治療及其損傷通路研究是臨床研究熱點(diǎn)問(wèn)題[10-11]。

淹溺型肺損傷主要可分為海水所致肺損傷與淡水所致肺損傷兩種類型，因海水與淡水主要溶質(zhì)成分、理化性質(zhì)不同，損傷機(jī)制也有所差異：一般認(rèn)為高滲透海水能直接破壞肺上皮細(xì)胞，破壞該處通透性，導(dǎo)致肺水腫發(fā)生，而淡水型肺損傷主因低滲透壓液體滲入肺泡組織內(nèi)，導(dǎo)致肺水腫發(fā)生，同時(shí)可被血液循環(huán)吸收，從而引起免疫激活以及溶血反應(yīng)發(fā)生，進(jìn)一步可致彌漫性血管炎癥發(fā)生[12-13]。兩者發(fā)生機(jī)制雖有不同，但都直接損傷肺組織，導(dǎo)致肺水腫發(fā)生，肺泡表面穩(wěn)定性下降，影響肺通氣換氣功能，同時(shí)均引起廣泛炎癥發(fā)生，導(dǎo)致肺組織進(jìn)一步受損，引起不可能肺部損傷，最終致使低氧血癥，呼吸衰竭發(fā)生[14-15]。

IL-8屬細(xì)胞白介素成員，是一種多源性細(xì)胞炎癥因子，是由單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞所分泌的，其具有白細(xì)胞趨化作用，且能誘導(dǎo)其他趨化因子，黏附因子合成，特別是對(duì)于T淋巴細(xì)胞及中心粒細(xì)胞，其具有強(qiáng)趨化激活作用，能夠使其在局部聚集，產(chǎn)生大量炎癥活性物質(zhì)，引起炎癥反應(yīng)發(fā)生[16-17]。表面活性蛋白家族(SP)是一種由肺泡內(nèi)皮細(xì)胞分泌的，構(gòu)成肺表面活性物質(zhì)的主要蛋白結(jié)構(gòu)，SPB為其主要分泌蛋白，其能保持肺泡穩(wěn)定性，降低表面張力，維持通氣血流平衡，在急性肺損傷過(guò)程中，表面活性物質(zhì)質(zhì)量與性質(zhì)改變與病程發(fā)展直接相關(guān)[18]。研究發(fā)現(xiàn)SPB蛋白能維持表面活性物質(zhì)中磷脂分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，其能調(diào)節(jié)單分子與雙分子層結(jié)構(gòu)與形態(tài)，使表面張力穩(wěn)定在合適范圍內(nèi)，避免肺不張發(fā)生，其還可在低氧環(huán)境下保證肺通氣換氣過(guò)程正常進(jìn)行，起到肺組織保護(hù)作用[19]。

本研究擬探究IL-8與SPB蛋白在淹溺型肺損傷中的表達(dá)情況，試探究其在淹溺型肺損傷中的表達(dá)意義。建模采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)成年新西蘭兔，麻醉氣管插管完成后，經(jīng)氣管插管向氣管內(nèi)注射3 mL/kg配置海水完成海水組建模，經(jīng)氣管插管向氣管內(nèi)注射18 mL/kg配置淡水完成淡水組建模。既往實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，海水中溶質(zhì)與淡水溶質(zhì)差異大，海水組使用與淡水組兔相同劑量建模時(shí)，已造成模型多器官損傷發(fā)生，造成非實(shí)驗(yàn)影響因素增加，實(shí)驗(yàn)誤差增加，在既往報(bào)道中認(rèn)為，該建模方式兩組新西蘭兔單純肺部損傷、低氧、組織炎癥發(fā)生程度相似，故本文采用此建模方式[12]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，海水組與淡水組W/D較對(duì)照組均明顯上升(P<0.05)，且兩組兔肺組織W/D無(wú)明顯差異(P>0.05)；提示兩組模型肺損傷程度相近。同時(shí)海水組與淡水組肺泡灌洗液中IL-8表達(dá)量較對(duì)照組表達(dá)均上升，SPB蛋白較對(duì)照組明顯下降(P<0.05)，且兩模型組兔肺泡灌洗液中IL-8及SPB蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)；海水組與淡水組肺組織中IL-8水平較對(duì)照組表達(dá)均上升，SPB水平較對(duì)照組明顯下降，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且兩組兔肺組織中IL-8及SPB蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)。

既往文獻(xiàn)報(bào)道及結(jié)合本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果，3 mL海水與18 mL淡水造模兩組兔肺損傷程度相近，兩組建模具有對(duì)比價(jià)值[2]。既往文獻(xiàn)報(bào)道兩種模型中的淹溺型急性肺損傷可能存在機(jī)制差異，但本文結(jié)果提示，在損傷程度相近時(shí)，兩組實(shí)驗(yàn)兔IL-8及SPB蛋白在兩種損傷模型中的表達(dá)情況情況相近，故可認(rèn)為不同機(jī)制下，淹溺型急性肺損傷實(shí)驗(yàn)兔肺組織內(nèi)IL-8及SPB蛋白均出現(xiàn)異常表達(dá)，可能參與急性肺損傷形成過(guò)程[17]。

我們認(rèn)為出現(xiàn)以上結(jié)果原因是：1)淹溺型急性肺損傷發(fā)生，無(wú)論是海水導(dǎo)致還是淡水導(dǎo)致，其重要機(jī)制均為廣泛肺部炎癥發(fā)生，在海水型淹溺肺損傷實(shí)驗(yàn)中，高滲性海水直接破壞肺泡壁完整性，導(dǎo)致肺上皮細(xì)胞受損，炎癥因子分泌增加，故導(dǎo)致IL-8濃度明顯上升，而在淡水型淹溺肺損傷實(shí)驗(yàn)中，低滲性淡水直接進(jìn)入血管，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)激活，IL-8分泌增加，引起炎癥趨化作用發(fā)生；2)在海水型淹溺肺損傷實(shí)驗(yàn)中，高滲性海水破壞肺泡完整性，導(dǎo)致肺上皮組織功能障礙，SP主要由肺上皮細(xì)胞分泌，SPB為其主要活性成分，故SPB在海水型淹溺肺損傷中表達(dá)明顯下降，而淡水型淹溺肺損傷實(shí)驗(yàn)中，低滲性淡水直接進(jìn)入肺泡，導(dǎo)致肺泡內(nèi)低滲透壓，液體進(jìn)入肺泡組織，導(dǎo)致肺水腫發(fā)生，影響肺上皮細(xì)胞分泌功能，導(dǎo)致SPB分泌減少；3)兩型淹溺肺損傷均造成肺部廣泛炎癥發(fā)生，直接破壞肺上皮細(xì)胞功能，也導(dǎo)致SPB分泌較對(duì)照組明顯減少。另外我們注意到盡管海水與淡水致肺損傷機(jī)制并不完全相同，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近，這可能是因?yàn)楸M管兩者致?lián)p原因不同，但均是引發(fā)炎癥浸潤(rùn)，破壞正常肺組織，故兩者肺損傷病理結(jié)果相近，且IL-8與SPB蛋白均在該病理變化過(guò)程中承擔(dān)重要作用，病理標(biāo)本中IL-8與SPB蛋白表達(dá)量相近。

海水組及淡水組淹溺型急性肺損傷實(shí)驗(yàn)兔肺泡灌洗液 及肺組織IL-8及SPB蛋白表達(dá)量水平均明顯上升，SPB水平均明顯下降，提示IL-8表達(dá)增多及SPB蛋白表達(dá)下調(diào)參與該損傷發(fā)生過(guò)程密切相關(guān)。