支氣管肺發育不良患兒氣管抽吸物單核細胞檢測的臨床意義研究

邱成英 朱道謀 鄧穎云 盧磊 邢舒旺 曾唯峰

支氣管肺發育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)是早產兒常見的慢性呼吸系統疾病，由于肺發育不成熟以及肺表面活性物質缺乏，早產兒特別是胎齡<32周的極早產兒BPD的發病率可以達到70%以上[1]。BPD病因復雜，發病機制尚未明確，近期的研究顯示肺部炎癥失調，可以阻礙肺發育[2]，單核細胞是機體內常見的炎性細胞，其可以分為M1(經典活化巨噬細胞)和M2(替代活化巨噬細胞)兩個亞型，在炎癥反應中分別發揮不同的作用[3]。本研究檢測了BPD患兒氣管抽吸物中單核細胞亞型的變化，借此探討其與BPD的相關性。

資料與方法

一、研究對象

選取我院2018年 1月至 2019 年6月需要機械通氣治療的呼吸窘迫綜合征(RDS)早產兒62例，超過28天仍氧依賴患兒為BPD組，氧依賴未到28天患兒為對照組，納入對象：符合RDS[4]和BPD[5]診斷標準。排除標準：伴發先天性心臟病、肺畸形、遺傳代謝病或者難以獲得氣管抽吸物患兒。

二、單核細胞亞型的檢測

使用流式細胞儀(美國BD公司，LSRFortessa)檢測患兒氣管抽吸物中單核細胞亞型M1和M2所占的比例。FITC-CD68、FITC-CD86和FITC-CD163抗體購自美國Abcam公司，檢測方法簡述如下：患兒氣管抽吸物加入等體積的PBS緩沖液(含1%胰蛋白酶)，37 ℃消化90 min，1000 g離心10 min，收集細胞沉淀，0.5 mL PBS懸浮細胞，每份樣品按照抗體試劑盒說明書分別加入FITC-CD68、FITC-CD86或FITC-CD163，避光染色60min，置冰上送流式細胞儀檢測，以FL1通道做門，檢測CD68陽性單核細胞、CD86陽性M1和CD163陽性M2所占的比例。

三、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素 1(IL-1)和白介素 10(IL-10)的檢測

使用ELISA法檢測患兒氣管抽吸物中TNF-α、IL-1和IL-10表達水平。檢測試劑盒購自北京擎科新業生物技術有限公司，檢測方法簡述如下：患兒氣管抽吸物加入4倍體積的4%氫氧化鈉，37 ℃ 液化2 h，1000 g離心10min，取上清，按照試劑盒說明書加入相關試劑，美國貝克曼庫爾特公司生產AU5800全自動生化分析儀檢測各樣品吸光度值的變化，對照標準曲線計算各樣品中TNF-α、IL-1和IL-10表達水平。

四、統計學分析

SPSS 16.0統計軟件對數據進行統計學處理，計量資料用t檢驗；計數資料采用χ2檢驗，P<0.05為統計學有顯著性差異。

結 果

一、兩組早產兒一般臨床資料的比較

從表1可見兩組早產兒性別比例無顯著性差異(P> 0.05)，BPD組胎齡和出生體重顯著低于對照組(P<0.05)，用氧時間和機械通氣時間顯著高于對照組(P<0.01)(見表1)。

表1 兩組早產兒一般臨床資料的比較

二、兩組早產兒單核細胞以及其M1和M2亞型比例的比較

兩組早產兒氣管抽吸物中單核細胞比例無顯著性差異(P>0.05)，BPD組M1占7.65±1.28%，顯著高于對照組的3.57±0.54%(P<0.01)，BPD組M2占3.38±0.44%，顯著低于對照組的7.35±1.32%(P<0.01)(見表2，圖1)。

表2 兩組早產兒單核細胞以及其M1和M2亞型的比較

三、兩組早產兒TNF-α、IL-1和IL-10表達水平的比較

BPD組早產兒氣管抽吸物中TNF-α和IL-1表達顯著高于對照組(P<0.01)，BPD組IL-10表達顯著高于對照組(P<0.01)(見表3)。

表3 兩組TNF-α、IL-1和IL-10表達水平的比較

討 論

支氣管肺發育不良(BPD)是早產兒最常見的后遺癥，近年來隨著早產兒存活率提高，BPD發生率也逐漸提高[6]，BPD患兒預示著慢性呼吸障礙和神經發育遲緩等不良后果，積極有效防治BPD是早產兒恢復正常生活質量的有力保障[7]。早產和出生低體重是BPD的重要危險因素，本研究觀察也顯示了BPD患兒胎齡和出生體重顯著低于對照組。

炎癥在BPD致病中發揮著重要的作用，臨床上皮質類固醇可以顯著降低BPD發生率以及嚴重程度，說明了調節炎癥反應可以預防早產兒BPD的發生[8]，單核巨噬細胞是炎癥常見的浸潤細胞[9]，但本研究顯示BPD組和對照組氣管抽吸物中單核細胞比例無顯著性差異，最近研究顯示單核細胞分為M1和M2兩種亞型，單核細胞向M1極化時細胞主要分泌TNF-α和IL-1促進炎癥發生，向M2極化時分泌IL-10減輕炎癥過程，促進組織修復和再生[10]。在哮喘的研究中發現M2具有促進組織重建和恢復肺組織微環境平衡的作用[11]，孫瑤[12]等的研究顯示間充質干細胞誘導單核巨噬細胞向M2型巨噬細胞極化后可以治療急性肺損傷，上述結果說明了單核細胞的不同極化表型是一些炎癥性損傷的調節反應。本研究觀察發現BPD組患兒氣管抽吸物中M1所占比例顯著高于對照組，而M2所占比例又顯著低于對照組。上述結果說明了BPD患兒單核細胞向M1極化增多，而向M2極化減少，進一步研究單核細胞極化機制，或者調解極化方向將會為BPD提供一個很好的治療策略。

圖1 單核細胞以及其亞型的流式細胞儀檢測

綜上所述，本研究顯示BPD患者單核細胞主要向M1亞型極化，M1比例升高的早產兒要注意預防發展成BPD的可能，調控單核細胞向M2極化有可能成為BPD治療的靶點。