miR-618 在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義

谷士海 傅文生 邢化志

肺癌是全球常見惡性腫瘤之一，根據組織類型和臨床病理特征可以將肺癌分為非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)和小細胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)，其中NSCLC更為多見[1-2]。目前NSCLC的治療主要包括手術、放療、化療和靶向治療，雖然治療技術取得了進步，但是NSCLC患者的預后仍然較差，5年總生存率約為15%左右，肺癌的治療仍然是巨大的挑戰[3-4]。分子靶向治療可以精確的靶向腫瘤關鍵分子，改變其異常表達、阻斷其異常功能從而抑制腫瘤的惡性生物學行為，達到治療腫瘤的目的，已經證實多種分子靶向藥物可以治療NSCLC，并取得了較顯著的療效，但是靶向治療同樣存在耐藥現象[5-6]，因此新的靶向分子仍需研究開發。

大量研究表明多種腫瘤中均存在微小RNAs(micro RNAs, miRNAs)異常表達，miRNAs參與調控腫瘤細胞增殖、侵襲轉移、凋亡和耐藥等惡性生物過程，并發揮關鍵作用[7-9]，越來越多的研究報道miRNAs可以作為藥物靶點抑制惡性腫瘤的進展[10-11]。miR-618被報道為腫瘤抑制因子，在胃癌、前列腺癌、甲狀腺癌等常見腫瘤發病過程中均發揮重要作用，是潛在的腫瘤治療靶點[12-14]，然而目前少有關于miR-618與NSCLC相關的報道，miR-618是否參與了NSCLC的發生、發展還有待相關研究進行驗證。本文通過研究miR-618在NSCLC中的表達及與患者臨床病理參數和預后的關系，以期為miR-618作為NSCLC治療候選靶點的臨床應用提供實驗基礎數據。

資料與方法

一、臨床資料

資料概況：本研究經醫院倫理委員會審核通過。共收集2012年1月-2014年1月NSCLC組織和其配對的癌旁組織手術標本85例，其中患者年齡23～75歲，平均年齡(55.38±11.64)歲，男49例，女36例，腺癌44例，鱗癌41例，腫瘤直徑：≤3 cm者43例，3 cm>者42例，TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期51例，Ⅲ～Ⅳ期34例，分化程度：中高分化55例，低分化30例，有淋巴結轉移者40例，無淋巴結轉移者45例。

納入標準：(1)在我院行手術治療，經手術病理切片證實為NSCLC；(2)具有完整的病例和隨訪資料；(3)所有患者均簽署知情同意書。

排除標準：(1)術前接受化療、放療、免疫和靶向等抗腫瘤治療者；(2)合并嚴重器質性疾病者；(3)合并其他腫瘤者；(4)合并有擴張性心肌病等影響miR-618表達的疾病者。

二、材料與試驗方法

1 試劑與儀器 PrimeScriptTM RT reagent Kit逆轉錄、TRIzol裂解液、SYBR Premix Ex TaqTM qRT-PCR試劑盒等均購自日本TaKaRa公司；氯仿、異丙醇、無水乙醇等試劑均購自南京潤升石化有限公司；miR-618和內參GAPDH引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成；Nondrop 2000 微量分光光度計購自美國Thermo公司；Mastercycler Ep Realplex實時熒光定量PCR儀購自德國Eppendorf公司。

2 qRT-PCR檢測miR-618的相對表達量 切除NSCLC組織及遠離腫瘤邊緣5 cm左右的癌旁組織，以組織勻漿機研碎后，加入1 mL TRIzol裂解液，之后加入200 μL氯仿后震蕩混勻靜置5 min，在低溫下(4℃)以12000 r/min的轉速離心30 min，吸取適量上層水相層溶液與等量的異丙醇混勻，在低溫下(4℃)以12000 r/min的轉速離心15 min，無水乙醇洗滌沉淀兩次，加入DEPC水溶解RNA。Nondrop 2000檢測RNA濃度，將總RNA按逆轉錄試劑盒說明書逆轉為cDNA。

miR-618引物F:3′-TGCTCTTGTTCACAGCCAAA-5′, R: 3′-GGTGATGCCA ATAACCCATC-5′；內參F:5'-CTCGCTTCGGCAGCACAING1-3′, R:5′-AACGCTTCACGA ATTTGCGT-3′。以cDNA作為模板進行qRT-PCR。每個樣品設置3個反應復孔，反應條件: 95 ℃預變性5 s，95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s 共計40 個循環，分析各樣品的循環閾值(threshold cvcle, Ct)，用2-ΔΔCt法分析目的基因相對表達量。

3 隨訪 所有患者在術后均進行隨訪，隨訪方式為電話及門診的方式進行定時隨訪，隨訪終點事件為為患者死亡或者隨訪時間達到60個月。

三、統計學分析

結 果

一、qRT-PCR檢測miR-618在NSCLC組織中的表達水平

qRT-PCR檢測miR-618在85例NSCLC組織和癌旁組織中的表達情況。結果顯示：miR-618在NSCLC組織中的平均表達水平為(0.78±0.48)，顯著低于癌旁組織(0.99±0.57)(配對檢驗t=2.653,P=0.009)。

二、NSCLC組織中miR-618的表達水平對患者預后的影響

根據上述檢測結果，將miR-618表達水平>0.78定義/劃分為miR-618高表達組(n=39)，≤0.78定義/劃分為miR-618低表達組(n=46)。對miR-618高、低表達兩組進行預后分析：以Kaplan-Meier繪制患者生存曲線，Log Rank檢驗分析結果。顯示：miR-618低表達的NSCLC患者的術后5年總生存率為15.22%(7/46)，顯著低于miR-618高表達的NSCLC患者的33.33%(13/39)，差異具有統計學意義(χ2=29.50，P=0.000)，且miR-618低表達組中位OS<28 個月，而miR-618高表達組中位OS>36 個月，miR-618低表達患者的術后OS比高表達患者顯著縮短(P<0.05)，即高表達的miR-618，可能是患者預后的積極影響因素(見圖1)。

圖1 NSCLC患者癌組織中miR-618的表達水平與患者術后OS的關系

三、miR-618在NSCLC組織中的表達水平與患者臨床病理參數之間的關系

分別計算比較各臨床病理指標不同水平層的miR-618表達水平，發現miR-618在NSCLC組織中的表達量差異與患者的年齡、性別、組織類型均無關(P>0.05)，而與腫瘤大小、分化程度、TNM分期和淋巴結轉移有關(P<0.05)(見表1)。

再對miR-618高、低表達兩組，分別比較其在各臨床病理指標不同水平層中的占比，發現其結果同上，即miR-618在NSCLC組織中的表達高低差異與患者的年齡、性別、組織類型均無關(P>0.05)，而與腫瘤大小、分化程度、TNM分期和淋巴結轉移有關(P<0.05)(見表1)。

結合數據看：腫瘤大小≥3 cm患者miR-618表達低于<3 cm者，低分化患者miR-618表達低于高分化者，腫瘤分期Ⅲ ～ Ⅳ患者miR-618表達低于Ⅰ～Ⅱ者，有淋巴結轉移患者miR-618表達低于無淋巴結轉移者。

表1 miR-618在NSCLC組織中的表達水平與臨床病理參數之間的關系

四、NSCLC患者miR-618的表達水平的影響因素分析

進一步建立非條件Logistic回歸模型，以NSCLC miR-618表達水平為應變量，賦值1=高表達(>0.78)，0=低表達(≤0.78)。以前述(表1)中P<0.10的指標/因素為自變量，初選了腫瘤大小等4個指標作為自變量。各變量賦值參見(表2)。回歸過程采用逐步后退法，以進行自變量的選擇和剔除，設定α剔除=0.10，α入選=0.05。回歸結果：4個變量均被保留入回歸方程(P<0.05)。提示：腫瘤大小、分化程度、TNM分期及淋巴結轉移均是miR-618表達水平的顯著影響因素(見表2)。

討 論

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤，其死亡率位居我國腫瘤相關死亡的第一位，嚴重危害人們生命健康，且近年來由于不良的生活習慣、工作壓力和環境的惡化等因素，肺癌的發病率仍具有上升趨勢[15]。肺癌具有兩種重要的組織類型，NSCLC和SCLC，兩者的治療方法不同，手術是NSCLC的主要治療手段，但是NSCLC晚期患者由于發生轉移，使得手術切除受限，且NSCLC對于化療和放療具有抵抗性，NSCLC的預后仍然不容樂觀。目前腫瘤的治療將進入精準靶向治療的時代，直接靶向腫瘤發生發展中關鍵分子可提高治療療效，具有與NSCLC治療和預后相關分子標記物的研究獲得越來越多的關注[16-17]。NSCLC具有腫瘤異質性，發病過程錯綜復雜，其發生發展的具體分子機制仍未完全明確，因此在分子水平研究NSCLC發病過程中具有重要作用的分子，可能為NSCLC提供新的治療策略。

表2 NSCLC患者miR-618的表達水平的Logistic回歸結果

MiRNAs是研究最為廣泛的非編碼RNA，miRNAs屬于單鏈小RNA，長度為17～25個核苷酸，不能編碼蛋白質，通過與靶基因的3'非翻譯區(3'-UTR)結合負調控靶基因的表達[7-8]。miRNAs可充當致癌基因或腫瘤抑制因子，調控多條信號通路，在腫瘤發生發展過程中發揮重要作用，越來越多的研究報道miRNAs可作為藥物靶點，具有治療腫瘤的潛能[10-11]，NSCLC中同樣存在異常表達的miRNAs[18-19]，miR-618為新近報道的miRNA，其異常表達可引起擴張性心肌病[20]和人類惡性腫瘤等疾病的發生[12-14]，已有的關于miR-618報道中，在腫瘤方面的研究相對較多，Shi等[12]采用qRT-PCR 檢測發現miR-618在胃癌組織中表達下調，并通過靶向TGF-β2抑制胃癌細胞的侵襲和遷移能力；miR-618在轉移性雄激素非依賴性前列腺癌中表達下調，miR-618低表達的患者預后較差，敲低miR-618的表達促進前列腺癌細胞遷移和侵襲，并誘導上皮細胞向間充質細胞的轉化[13]；miR-618在甲狀腺癌中表達下調，過表達miR-618通過抑制PI3K/Akt信號通路抑制甲狀腺細胞增殖并誘導G2/M期細胞阻滯[14]。多個研究已經證實miR-618發揮的抑癌因子的作用，miR-618在NSCLC中發揮的作用尚未明確。本文采用qRT-PCR檢測miR-618在85例NSCLC組織和癌旁組織中的表達水平，發現miR-618在NSCLC組織中的表達水平低于癌旁組織，表明在NSCLC中miR-618可能是抑癌因子。

本研究分析了NSCLC中miR-618表達的臨床意義及其影響關系。考慮到NSCLC的發病率和死亡率均可能與患者年齡、性別、組織類型、腫瘤大小、分化程度、TNM分期和淋巴結轉移均有關，因此檢測分析miR-618的表達在NSCLC患者各臨床病理特征分層中的差異，對miR-618不同表達水平組進行Kaplan-Meier生存分析。結果顯示：miR-618低表達的NSCLC患者的術后5年總生存率顯著低于miR-618高表達的NSCLC患者，miR-618低表達組中位OS<28個月，顯著低于miR-618高表達組中位OS>36個月。說明miR-618的表達與患者的預后密切相關，高表達對患者預后有積極影響。

進一步通過單因素和多因素Logistic回歸，發現miR-618的表達水平與患者的年齡、性別、組織類型無關，與腫瘤大小、分化程度、腫瘤分期及淋巴轉移等因素密切關聯(P<0.05)，提示它們均是miR-618表達的影響因素。結合數據看：腫瘤大小≥3 cm患者miR-618表達低于<3 cm者，低分化患者miR-618表達低于高分化者，腫瘤分期Ⅲ ～ Ⅳ患者miR-618表達低于Ⅰ～Ⅱ者，有淋巴結轉移患者miR-618表達低于無淋巴結轉移者。

綜上所述，miR-618在NSCLC中表達下調，與腫瘤大小、分化程度、TNM分期和淋巴結轉移及預后相關，具有重要的臨床意義，可能是腫瘤治療的潛在靶點。