長鏈非編碼RNA EXOC7在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義分析

杜小梅 呂建寧 李雯

肺癌是最常見的癌癥形式，也是全世界癌癥相關性死亡的主要原因[1]。非小細胞肺癌是肺癌最常見的腫瘤類型，約占肺癌患者總數的85%左右[2]。目前，有關非小細胞肺癌的早期診斷和治療仍是我國乃至世界迫切需要解決的一個難題。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是近年來發現的一類可參與腫瘤細胞增殖、遷移、凋亡等多個層面調控的不編碼蛋白質的RNA[3-4]。最近有研究通過芯片技術發現lncRNA EXOC7在肺癌、肝癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤腫表達異常[5-7]，但尚未有研究加以進一步驗證。因此，本研究采用實時定量反轉錄聚合酶鏈反應(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR)方法檢測了lncRNA EXOC7在非小細胞肺癌組織中的表達情況，并進一步分析了其表達與非小細胞肺癌患者臨床病理特征及預后的關系。

資料與方法

一、臨床資料

本研究納入2015年1月至2018年5月收治的75例非小細胞肺癌患者，其中男性43例，女性32例，年齡38～84歲，中位年齡59歲。所有患者均經病理學確診為原發性非小細胞肺癌，入組前未接受任何放化療等治療，均接受手術治療，將術中取出的新鮮非小細胞肺癌組織的二分之一及對應癌旁組織放入液氮冷凍處理，并于-80℃保存待測，另外二分之一的癌組織放入福爾馬林中保存，制作成蠟塊待用。

二、qRT-PCR法檢測非小細胞肺癌組織及癌旁組織中lncRNA EXOC7的表達

將50 mg左右組織樣本進行超聲勻漿，參照Trizol試劑盒(Thermo Fisher公司)操作說明書提取組織總RNA，DEPC水溶解，應用Nanodrop 2000超微量分光光度計(Thermo Fisher公司)檢測總RNA的純度及濃度。參照逆轉錄試劑盒(Takara公司)操作說明書進行逆轉錄反應，反應體系為20 μL：總RNA 1 μL、PrimeScript RTase 1 μL、dNTP Mixture 1 μL、5×PrimeScript Buffer 0.5 μL、5×PrimeScript Buffer 4 μL、Oligo dT Primer 1 μL，DEPC水補至20μL。反應條件：25 ℃ 10 min，37℃ 40 min，90℃ 5 min，產物置于4℃保存待用。根據 Genebank數據庫中lncRNA EXOC7參考序列設計用于實時定量 PCR 的引物，并以GAPDH 作為內參。lncRNA EXOC7引物序列：上游引物5′-CTGGGATCAGAGAGCAAAGG-3′，下游引物5′-CTGTAGAAAGGCCCCG-3′；GAPDH 引物序列：上游引物5′-CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA-3′，下游引物5′-ATGATCTT2GAGGCTGTTGTCATA-3′。參照實時定量 PCR試劑盒(Takara公司)操作說明書進行操作，反應體系為25 μL：cDNA模板 2 μL、上下游引物各 1 μL、2×SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL，滅菌蒸餾水補至25 μL。反應條件：95 ℃ 1 min預變性，95℃ 20s，55℃ 30s，72℃ 30s，35個循環。采用2-△△CT方法計算目的基因的表達水平，每組取三個復孔均值，目的基因相對表達量=2-ΔΔCt值(目的基因)- 2-ΔΔCt值(GAPDH)。

三、隨訪

隨訪起點為手術日期，隨訪截止2019年5月 31 日，患者的隨訪時間為12～40個月，中位隨訪時間為28個月，隨訪主要為電話隨訪和門診隨訪兩種方式，隨訪內容包括一般情況、臨床癥狀及影像學檢查。

四、統計學分析

結 果

一、lncRNA EXOC7在非小細胞肺癌及癌旁組織中的表達

非小細胞肺癌組織中lncRNA EXOC7的相對表達水平(7.88±1.04)明顯高于癌旁組織(1.33±0.79)，差異具有統計學意義(P<0.001)(見圖1)。

圖1 lncRNA EXOC7在非小細胞肺癌及癌旁組織中的表達

二、非小細胞肺癌組織中lncRNA EXOC7的表達與患者臨床病理特征的關系

不同性別、年齡、病理類型、組織分化程度的非小細胞肺癌患者組織中lncRNA EXOC7的表達無明顯差異性(P>0.05)，但不同TNM分期、淋巴結轉移狀況與非小細胞肺癌患者組織中lncRNA EXOC7的表達存在顯著差異性(P<0.05)(見表1)。

表1 非小細胞肺癌組織中lncRNA EXOC7的表達與患者臨床病理特征的關系

三、非小細胞肺癌組織中lncRNA EXOC7的表達與患者預后的關系

根據75例非小細胞肺癌患者癌組織中lncRNA EXOC7的表達水平，將其分為高表達組(≥7.88)和低表達組(<7.88)，其中高表達組29例，占36.11%，低表達組46例，占63.89%。高表達組無進展生存期[(10.09±1.93)個月]明顯短于低表達組[(19.77±2.16)個月]，差異有統計學意義(P<0.05)(見圖2)。高表達組總生存期[(14.82±2.05)個月]明顯短于低表達組[(26.18±2.87)個月]，差異有統計學意義(P<0.05)(見圖3)。

討 論

非小細胞肺癌是一種嚴重危害人們健康的惡性腫瘤，國內外的發病率和死亡率均位居前列，盡管醫藥技術領域發展迅猛，但非小細胞肺癌的總體療效仍不盡如人意[8-9]。因此，深入探究非小細胞肺癌的分子生物學特點及其可能的發病機制，對于探尋新的治療靶點意義重大。

圖2 lncRNA EXOC7表達與非小細胞肺癌患者無進展生存期的關系

圖3 lncRNA EXOC7表達與非小細胞肺癌患者總生存期的關系

由于lncRNA是一類不編碼蛋白質的RNA，在發現初期并未獲得足夠重視，然而，隨著研究的不斷深入，科研人員們開始發現lncRNA可在表觀遺傳學、基因組轉錄水平及轉錄后水平等多個層面上調控基因的表達[10-11]。值得注意的是，越來越多的研究發現lncRNA在腫瘤細胞增殖、遷移、凋亡等多個方面發揮重要的調控作用[12-14]。盡管目前在非小細胞肺癌中發現了多種lncRNA[15-16]，但迄今為止，lncRNA與非小細胞肺癌的關系尚不明確。最近有研究通過芯片技術發現lncRNA EXOC7在包括非小細胞肺癌在內的多種惡性腫瘤腫表達異常[17]，但尚未有研究加以進一步驗證。因此，我們猜想lncRNA EXOC7有可能成為非小細胞肺癌治療的新的突破口。

本研究結果顯示，非小細胞肺癌組織中lncRNA EXOC7的相對表達水平顯著高于癌旁組織，表明lncRNA EXOC7在非小細胞肺癌組織中表達上調。我們進一步分析了lncRNA EXOC7表達與非小細胞肺癌患者臨床病理特征，結果發現，不同性別、年齡、病理類型、組織分化程度的非小細胞肺癌患者組織中lncRNA EXOC7的表達無明顯差異性(P>0.05)，但不同TNM分期、淋巴結轉移狀況與非小細胞肺癌患者組織中lncRNA EXOC7的表達存在顯著差異性(P<0.05)，表明lncRNA EXOC7的表達與的發生及轉移有關，其可能在非小細胞肺癌中發揮促癌作用。

本研究進一步分析了lncRNA EXOC7表達與非小細胞肺癌患者預后的關系，結果發現lncRNA EXOC7高表達組無進展生存期明顯短于低表達組，并且總生存期也明顯短于低表達組，表明lncRNA EXOC7高表達，可能與非小細胞肺癌患者的不良預后有關。

綜上所述，lncRNA EXOC7在非小細胞肺癌組織中表達上調，其可能作為一種促癌因子參與非小細胞肺癌的發生及發展過程，并與患者的不良預后有關。但有關lncRNA EXOC7調節非小細胞肺癌患者發生發展的具體作用機制仍需今后進一步深入探討。