高鐵血紅蛋白還原試驗在G6PD缺乏癥女性雜合子篩查中的應用價值

胡玲玲，李磊，周穎娟

（珠海市婦幼保健院檢驗科，廣東 珠海 519000）

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）缺乏癥是常見的遺傳性酶缺乏疾病，為X連鎖不完全顯性遺傳病，我國各地區發病率有較大差異，高發區集中在長江流域以南[1]。致病基因位于Xq28[2]，由13個外顯子和12個內含子組成，因女性有兩個X染色體，故有兩個G6PD基因，女性的基因型分為正常，缺乏雜合子以及缺乏純合子，因兩個X染色全部缺陷的可能性較小，故女性G6PD缺乏的主要形式是以雜合子存在。G6PD缺乏雜合子酶活性變化范圍較大，可以表現為正常、中度缺乏和重度缺乏，而男性半合子G6PD缺乏活性一般呈顯著性缺乏，嚴重者可導致新生兒期核黃疸，引起死亡或永久性神經系統的損傷[3]。現階段各實驗室用于G6PD缺乏篩查的主要方法為高鐵血紅蛋白還原法和熒光斑點法。本研究收集2019年5月-9月期間前來本院進行孕前檢查的2096份女性標本，應用上述兩種方法作為初篩試驗，并對所有樣本應用高分辨熔解曲線法作為G6PD缺乏癥的確證實驗，以期評價上述兩種常用初篩方法在G6PD缺乏女性雜合子篩查中的應用價值。

1 對象與方法

1.1 對象 2019年5月-9月期間前來珠海市婦幼保健院進行孕檢的珠海籍女性2096人，年齡為22-40周歲，血紅蛋白檢測值均在115-150 g/L。采用EDTA抗凝真空管抽血3 mL。

1.2 方法

1.2.1 G6PD熒光斑點法 將血滴入濾紙片形成血斑待干燥，用打孔器在血片上打下一直徑3 mm的血片于反應試管中，加入反應混合液100 μL，置37oC孵育箱中10 min，取約2.5 μL血斑混合反應液滴于濾紙上，用風筒吹干后置于紫外燈下觀察熒光情況。結果判斷：熒光強度++時，熒光斑點光亮，判斷為G6PD正常；熒光強度+--時，為G6PD缺乏陽性，判斷為輕-中度缺乏；斑點暗淡表示無熒光，判斷為重度缺乏。

1.2.2 MHB-RT法 按第3版《全國臨床檢驗操作規程》方法進行試劑配制和操作，試劑為1.25%亞硝酸鈉葡萄糖、0.0004 mol/L美蘭溶液。結果判斷：高鐵血紅蛋白還原率＜75%為缺乏陽性，≥75%為正常。

1.2.3 熒光PCR熔解曲線法 采用廈門致善生物技術有限公司的G6PD基因檢測試劑盒，可檢出中國人群常見的16種突變類型，操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.3 統計學分析 采用SPSS 13.0軟件包進行率的比較。采用卡方檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MHB-RT法和熒光斑點法檢出率 對2096例孕檢女性進行G6PD篩查檢測，女性陽性檢出率為12.36%。熒光斑點法篩查時，陰性標本2040例，陽性標本56例，高鐵血紅蛋白還原率≥75%的樣本有1852份（即陰性結果有1852份），高鐵血紅蛋白還原率＜75%的標本有244份（即陽性結果有244份）；兩種方法陰性符合率為90.8%。其中熒光斑點為中到重度缺乏的樣本用MHB-RT法可100%檢出。見表1。

2.2 MHB-RT法與熒光PCR法 采用高分辨熒光熔解曲線法對MHB-RT陽性樣本進行批量檢測，其中222例基因確診陽性，22例為正常，假陽性率為1.2%，余1852例MHB-RT陰性樣本有37例確診為G6PD缺乏患者，假陰性率14.3%，檢測靈敏度為85.7%（222/259），特異度為98.8%（1815/1837）。基因突變位點分別為：c.1376G＞T 102例，c.1388G＞A 93例，c.95A＞G 34例，c.1024G＞T 19例，c.871G＞A 7例，c.392G＞T 2例，c.1388 G＞A/95A＞G 1例，c.1388G＞A/1024 G＞T 1例。MHB-RT法與高分辨熒光熔解曲線法檢測結果比較，其檢出率經χ2檢驗可知χ2=0.508，P=0.476，說明兩種方法比較，差異無統計學意義，其吻合性經Kappa系數檢驗可知K=0.916，P=0.001，說明兩種診斷方法的吻合度有統計學意義，見表2。

表1 MHB-RT和熒光斑點法檢測結果（例）

表2 MHB-RT和高分辨熒光熔解曲線法檢測結果（例）

2.3 熒光斑點法與熒光PCR法 在熒光斑點試驗陰性的2040例樣本中有212例為基因確診陽性，假陰性率為81.9%，56例樣本中有9例假陽性，假陽性率為0.5%。檢測靈敏度為18.1%（47/259），特異度為99.5%（1828/1837）。熒光斑點法與高分辨熒光熔解曲線法檢測結果比較，其檢出率經χ2檢驗可知χ2=141.451，P=0.000，說明兩種方法比較，差異有統計學意義，其吻合性經Kappa系數檢驗可知K=0.266，P=0.000，說明兩種診斷方法的吻合度較差，差異有統計學意義。檢測結果見表3。

表3 熒光斑點法和高分辨熒光熔解曲線法檢測結果（例）

2.4 熒光斑點與MHB-RT法 G6PD熒光斑點活性與MH-RT檢測結果比較，檢出率經χ2檢驗可知χ2=10.044，P=0.002，說明兩種方法比較，差異有統計學意義。因為檢測方法敏感性的不同，兩方法對女性雜合子檢出率存在差異。

3 討論

G6PD缺乏癥由于無法根治，只能對癥治療及預防發病，故在人群中特別是產檢和婚檢中進行快速有效的篩查顯得尤其重要。本文主要是探究熒光斑點法和高鐵血紅蛋白還原法兩種初篩試驗在女性雜合子攜帶者中的優越性差異。因男性半合子和女性純合子G6PD缺乏時，其酶活性常常為重癥缺乏，熒光斑點法和高鐵血紅蛋白還原法對于此類缺乏者篩查敏感性均為100%，兩種方法無明顯差異。對于女性雜合子的篩查，MHB-RT法有著較高的靈敏度，與G6PD確診檢測方法熒光PCR法相比檢出率無明顯差異，且與確診方法吻合度較高。而熒光斑點檢測方法假陰性率較高，漏診情況嚴重，其檢出率與確診方法相比差異有統計學意義，且吻合度較差，不符合初篩試驗應具有較高靈敏度的要求，故MHB-RT法對女性雜合子G6PD缺陷的初篩效果明顯優于熒光斑點法。我們通過研究發現，在合適的底物濃度和反應溫度下，反應時間更為重要[4]。這是由于部分屬于輕、中度缺陷的雜合子患者紅細胞中NADPH生成不足，硝基四氮唑藍不能充分還原。在篩查過程中易于將這部分屬于輕、中度缺陷的女性雜合子漏檢。在實驗中我們發現G6PD篩查的樣本最好能在24 h內檢測，必要時洗滌紅細胞以排除白細胞和血小板的影響。據報道，c.1376G＞T、c.1388G＞A、c.95A＞G和c.871G＞A幾個熱點突變，檢出率可達70%，本研究中，上述四種突變點檢出率達到91.1%，略高于文獻報道檢出率[5]，本地區突變以1376G＞T為主，為本地區女性攜帶者中的突變熱點。

熒光斑點實驗需要長波紫外光燈及氧化型谷胱甘肽（GSSG），判斷結果受主觀因素影響大[6-7]，MHB-RT法成本低，方法簡便，實驗穩定，應用MHB-RT法檢測女性G6PD缺陷，能更客觀更準確篩查G6PD缺陷癥，尤其對女性雜合子的早期篩查、早期診斷、早期預防提供可靠的診斷依據，減少漏診和誤診。在疾病高發地區可開展G6PD缺乏癥的產前酶活性篩查，為育齡人群提供G6PD缺乏癥的宣傳教育和遺傳咨詢[8]。特別是在基層醫院中，由于儀器設備等限制，MHB-RT法不失為快速篩查G6PD缺陷癥的好方法[8]。本研究中，由于樣本均為女性，所以對本地區的G6PD缺乏率仍需更大樣本量待進一步研究。