外源六價鉻在土壤中的有效性及其小麥毒性效應

彭葉棉，楊陽，侯素霞，程鵬飛，宋旭昕，楊澤勝，劉同旭*

1. 中國科學院廣州地球化學研究所，廣東 廣州 510640；2. 廣東省生態環境技術研究所/廣東省農業環境綜合治理重點實驗室，廣東 廣州 510650；3. 中國科學院大學，北京 100039；4. 邢臺職業技術學院資源與環境工程系，河北 邢臺 054000；5. 華南土壤污染控制與修復國家地方聯合工程研究中心，廣東 廣州 510650

鉻（Cr）因為熔點、沸點高，硬度大，抗腐蝕性強等特點而在中國高科技工業領域中占重要地位（陽倫莊等，2010）。鉻同時也是土壤、沉積物和地下水中第二常見的金屬污染物，其廣泛應用于電鍍、制革、印染、造紙、紡織、化肥、農藥制造等工業領域，產生人為和自然釋放鉻污染的過程進而導致嚴重的環境問題（Singh et al.，2013；Xia et al.，2019）。鉻在土壤生態中會影響土壤酶、微生物等的活性，提高了土壤生態的安全風險，超量的鉻還會對植物光合作用和營養吸收產生不利影響（Cai et al.，2019）。此外，植物中積累的鉻通過食物鏈進入人體，會導致皮炎、支氣管炎、結核病等，也增加了人類罹患癌癥的風險。

鉻的各種價態中，Cr(VI)和Cr(III)是最常見、最穩定的形式。Cr(VI)是一種強氧化劑，以四面體氧化物的形式存在，具有致癌性、誘變性和致畸性（Choppala et al.，2013；Zhitkovich，2011）。Cr(VI)在土壤中具有高流動性和植物毒性，而Cr(III)相對更穩定，更容易被土壤顆粒固持，且在環境中毒性較低（Brown et al.，1999）。Cr(VI)對動物、人類和植物均為有害物質，但Cr(III)是動物和人體的重要組成成分，而Cr(III)是否為植物必需元素仍存在爭議（Gardea-Torresdey et al.，2005）。Sharma et al.（2003）認為，鉻并非植物的必需元素，Cr(III)也不是植物必需的營養物質。此外，已有研究表明，外源Cr(III)進入土壤環境后，主要以Cr(III)的形式存在，而Cr(VI)處理的土壤中，大部分鉻容易轉化為Cr(III) （Han et al.，2004；Chen et al.，2010）。毒性不同的Cr(VI)和Cr(III)在環境中的有效態含量也存在差異，它們可以在土壤環境中相互轉換，這使得土壤-植物體系內鉻有效性較難評估。中國目前農田土壤中鉻污染的風險評估依然缺乏統一標準，因此建立適用于農田土壤的鉻有效性評價模型具有重要意義。

大量關于鉻在土壤-植物體系有效性的研究采用全量鉻作為評價因子，但全量鉻與土壤中的生物有效態鉻含量具有較大差異，這些評估方法依然有待完善（Muhammad et al.，2017）。McLaughlin et al.（2014）的認為土壤中提取態的化學物質可作為生物積累或毒性的預測因子，其研究結果表明提取態鉻與有效態鉻具有很好的關聯性。于是本研究以小麥（TriticumL.）根伸長為測試終點，以提取態鉻及其價態分配作為模型參數，建立了區分Cr(VI)和Cr(III)毒性作用的預測模型。該研究可以補充中國土壤鉻的植物毒性數據，也為建立農田土壤中鉻的環境質量標準提供了依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試的6種典型農田土壤來自中國 6個不同地區，土壤取樣深度為0—20 cm，風干后研磨，過0.15 mm的尼龍篩。對土壤樣品進行了pH、陽離子交換能力（CEC）、有機質、非晶質鐵、錳、鋁氧化物等性質的測定（魯如坤，2000），比表面積（BET）采用BET氮吸附法測定（Wang et al.，2018）。土壤中全量鉻的測定使用石墨爐消解法（HNO3-HF-HClO4）（15:2:2，V/V）對供試土壤樣品進行消解處理（Li et al.，2016），植物樣品用HNO3-HClO4（5:1，V/V）溶液進行消解（Yang et al.，2017）。采用電感耦合等離子體發射光譜法（ICP-OES，Optima 8000，PerkinElmer，USA）測定總鉻含量，使用紫外可見分光光度計（TU-1950，普析，中國）測量其中的Cr(VI)含量。供試土壤基本理化性質如表1所示。

表1 供試土壤基本理化性質Table 1 Physical and chemical characteristics of selected soils

1.2 試驗設計

1.2.1 污染土壤的制備

外源添加一定量Cr(VI)污染液到盛裝土壤的培養器皿中，混合均勻，配制成不同質量濃度的鉻污染土（編號如表2所示），每個處理3個重復。保持持水量 (70%±5%)，老化平衡1個月后進行小麥根伸長測試，并測定污染土壤的提取態總鉻和Cr(VI)含量（備注：Cr(III)含量等于總鉻含量減去Cr(VI)含量）。提取態鉻的測定使用 1 mol·L-1NH4OAc（pH=5）進行化學提取（Yu et al.，2002）。

表2 不同處理水平污染土壤的Cr質量比Table 2 Chromium concentration of polluted soils with different treatment levels

1.2.2 小麥根伸長測試

試驗所用小麥種子由劉志勇研究員提供（中國科學院遺傳與發育生物學研究所，北京）。小麥種子催芽后移植到塑料花盆中，埋入土壤約 1 cm深處，定期澆水，5 d后采樣。試驗在恒溫培養室內進行，生長條件為白天22 ℃，夜間18 ℃。采集完植物樣品后采集盆栽中污染土壤，及時測定提取態總鉻和Cr(VI)含量、全量Cr。用去離子水清洗小麥根系，測定根長。整株樣品殺青后（105 ℃，30 min）置于烘箱中（70 ℃）干燥，至恒重。測定樣品干重后粉碎過0.5 mm尼龍篩，儲存于干燥處。植物樣品重金屬含量測定前用HCl-HNO3溶液（3:1，V/V）進行微波消煮（黎森等，2019）。

1.3 數據分析

1.3.1 富集系數

本研究采用外源法計算生物富集系數（BCF），暨植物樣品中金屬含量與土壤中金屬含量扣除背景值后的比值（代允超等，2018）。計算方程式為：

式中，F——外源法生物富集系數；Cplant——添加鉻處理的小麥中鉻質量比，mg·kg-1；Cplant-CK——對照處理的小麥中鉻質量比，mg·kg-1；Csoil——添加鉻處理的土壤中鉻質量比，mg·kg-1；Csoil-CK——對照處理土壤中鉻質量比，mg·kg-1。

6種土壤不同處理下富集水平如圖1所示。

圖1 不同土壤中小麥的鉻含量Fig. 1 The Cr content of wheat in different soils

1.3.2 毒性閾值

參考ISO 11269的小麥根伸長實驗方法，計算小麥相對根長（ISO 11269，2012）。然后用Oringin 9.0軟件中的Growth-Dose-Resp方程擬合劑量-效應關系，并繪制劑量效應曲線圖。擬合方程如下：

式中Y代表相對根伸長，X代表外源鉻的質量濃度。X0、A1、A2均為擬合所得參數。EC10、EC20和EC50分別為小麥根伸長產生10%、20%和50%抑制效應時對應的Cr質量比。

1.3.3 分配系數

Cr(III)、Cr(VI)的生物有效性共同作用于土壤-植物體系，為了區分其影響，根據式（3）、（4）計算Cr(III)與Cr(VI)在提取態總鉻中的分配比值。

試驗所有數據均采用 Microsoft Office Excel 2010進行數據統計，IBM SPSS statistics 20進行統計分析，Oringin 9.0進行作圖。

2 結果與分析

2.1 不同土壤中小麥對鉻的富集

如圖1所示，在5—175 mg·kg-1范圍內，各處理的質量濃度越高，土壤上種植的小麥富集的鉻含量也越高。其中，陜西土壤種植小麥鉻含量最高可達 813.76 mg·kg-1，相同處理下（T7=175 mg·kg-1），重慶和河南僅為 302.41 mg·kg-1和 222.87 mg·kg-1。由圖2可知，所有處理下，小麥富集系數均大于1，相同處理下的各土壤之間富集系數存在差異。土壤鉻質量分數在5—175 mg·kg-1范圍內時，所有土壤上小麥富集系數均隨著外源鉻含量的升高而降低，直至小麥根系停止生長。T7處理下6種土壤之間富集差異顯著，重慶、河南土壤富集因子較高，而T1處理下，陜西、四川土壤富集因子高于重慶等土壤。

圖2 不同處理下6種土壤中富集系數的變化Fig. 2 Variation of BCF (biological concentration factor) in six soils among different treatments

2.2 基于根伸長的土壤Cr小麥毒性閾值

重金屬與小麥的根直接接觸可產生毒害作用，而可以通過小麥根伸長來評價（趙淑婷等，2018）。根據圖3可知，隨著土壤中鉻的質量濃度的升高，小麥根的相對根伸長（%）逐漸降低。河南、陜西和河北土壤在T2、T3處理水平下（質量濃度：10—20 mg·kg-1）開始出現抑制根長現象，重慶和新疆土壤在 T4—T5處理水平下（質量濃度：30—50 mg·kg-1）才開始抑制根長。富集含量達到約 200 mg·kg-1時所有處理土壤種植的小麥根長均下降。根據小麥根長的數據利用劑量效應曲線擬合求得不同土壤中鉻對小麥的毒性閾值（EC10、EC20、EC50），見表 2。試驗結果表明，不同土壤間的毒性閾值差異顯著。根據表3所示，四川、河南、陜西以及河北土壤的 EC50毒性閾值（18.48—55.60 mg·kg-1）顯著低于重慶和新疆土壤（75.27—135.66 mg·kg-1）。

圖3 6種土壤種的小麥相對根伸長Fig. 3 Root elongation of wheat in six soils

表3 土壤鉻的毒性閾值（EC10、EC20、EC50）及其95%置信區間Table 3 Toxicity thresholds (EC10, EC20, EC50) and the 95% confidence interval of Cr in soil

2.3 土壤中的提取態鉻與外源鉻添加量的關系

根據圖4所示結果，定量外源鉻進入土壤中老化平衡一段時間后，不同土壤間可提取態鉻含量差異較大。隨著鉻質量濃度的升高，提取態總鉻含量升高，在T7，四川、陜西、河北土壤提取態總鉻質量分數分別為 64.63、81.77、78.90 mg·kg-1，而重慶土壤僅為 24.01 mg·kg-1。

2.4 不同形態鉻的有效性及其預測模型

2.4.1 有效性差異

對實測的全量鉻、提取態總鉻、提取態Cr(VI)與Cr(III)含量分別進行了測定，并利用相關性分析比較不同形態的鉻的有效性。對數化處理分析植物毒性與重金屬含量，可提高數據間方差變異的同質性（Liang et al.，2013）。因此，以相對根伸長作為其植物有效性的測試終點，與上述不同形態鉻含量（對數化處理）進行相關性分析，見圖5。統計分析的結果表明，對數化處理后土壤中不同形態的鉻含量與小麥相對根伸長相關關系均顯著。提取態總鉻與根伸長相關性要好于全量鉻（R2Extracted-Cr=0.741，R2Total-Cr=0.633）。Cr(VI)與 Cr(III)與相對根長相關性均顯著（R2Extracted-Cr(VI)=0.603，R2Extracted-Cr(III)=0.70），但二者顯著性均低于提取態總鉻。分析其原因可能為提取態總鉻更能反應Cr(VI)與Cr(III)兩種毒性的共同作用。

圖4 種植小麥后不同處理下實測土壤提取態總鉻含量Fig. 4 The content of Crextracted (extracted-Cr) in different Cradded (Crtreated) soils after planting wheat

2.4.2 預測模型

圖5 不同形態鉻含量與小麥根伸長的相關關系Fig. 5 Relationship between Relationship between Cr(VI)/Cr(III) content and relative root elongation of wheat

表4 以小麥根伸長為測試終點的有效性預測模型Table 4 Predicted models with relative root elongation of wheat as the end point of test

為區分Cr(VI)與Cr(III)各自的毒性作用，將對數化處理后的提取態總鉻、Cr(III)與 Cr(VI)在提取態總鉻中的分配比值與相對根伸長進行回歸分析。得到以小麥根伸長為測試終點的有效性預測模型，見表 4。lg(ω(Extracted-Cr))簡寫為 lg(E-Cr)，P3、P6見式（3）、（4）。提取態總鉻與小麥相對根伸長呈顯著負相關，而提取態Cr(VI)與Cr(III)在提取態總鉻中的比值則分別呈負相關和正相關。預測模型決定系數均為0.75，當RR為50%時的提取態總鉻含量暨提取態預測的EC50值。提取態總鉻含量代表的有效態Cr對植物毒性起主導作用，同時Cr(VI)與Cr(III)分配比的影響也不可忽視。

2.5 土壤中提取態Cr(VI)與Cr(III)的分配

如圖6所示，提取態Cr(VI)與Cr(III)在土壤中的分配會隨著外源鉻含量的增加發生變化。在 0—20 mg·kg-1范圍內，土壤中的提取態Cr(VI)與Cr(III)含量變化較小，土壤 Cr(VI)含量極低（＜1.19 mg·kg-1），而 Cr(III)含量略高于 Cr(VI)（1.76—3.83 mg·kg-1）。在T7處理水平下，土壤提取態Cr(VI)含量可達 13.16—59.36 mg·kg-1，而 Cr(III)含量為10.85—31.18 mg·kg-1，總體略低于 Cr(VI)。

土壤間提取態Cr(VI)與Cr(III)分配比變化情況存在差異，在 T7處理水平下，重慶土壤的提取態Cr(III)和 Cr(VI)含量分別為 10.85、13.16 mg·kg-1；陜西土壤 Cr(III)和 Cr(VI)含量分別為 22.41、59.36 mg·kg-1，河北土壤的提取態 Cr(III)和 Cr(VI)含量分別為 31.17、47.72 mg·kg-1。

3 討論

3.1 土壤中鉻的植物富集能力及毒性效應

Cr是植物的有毒和非必需元素，但Cr進入植物體內的初期階段，鉻的吸收需要與許多無機元素競爭以快速進入植物系統，再與根細胞液泡中的物質螯合而降低植物毒害（Shanker et al.，2005）。在植物體系中，Cr具有抑制其他無機元素的吸收，改變葉綠體結構使得小麥光合作用受損等作用，這些作用抑制了植物生長及代謝功能（Sharma et al.，1995）。本研究結果表明，在低質量濃度的鉻污染下，小麥根伸長抑制不明顯，對鉻的富集系數較高。但隨著土壤中鉻含量的增加，富集系數逐漸降低。這符合上述Cr進入植物的機制，土壤中Cr質量濃度較低時，Cr快速被植物吸收，由于植物自身抗毒害機制使得其毒性較小；但隨著其質量濃度的升高，植物吸收的鉻含量積累過多使得生長代謝等功能受損，同時也降低了鉻攝取，從而對鉻的富集含量也逐漸降低。

圖6 不同形態鉻的含量與小麥根伸長的相關關系Fig. 6 Relationship between Cr(VI)/Cr(III) content and wheat relative root elongation

López-Luna et al.（2009）的研究表明在 500 mg·kg-1的Cr(VI)下，小麥地上部分和地下部分富集含量分別為20.65、26.24 mg·kg-1。而本研究結果表明在質量濃度為175 mg·kg-1的Cr(VI)處理下，土壤為生長介質的小麥富集含量在 222.87—813.76 mg·kg-1之間。這與 López-Luna et al.（2009）的研究結果略有不同，小麥品種、土壤種類以及污染平衡時間的差異可能是導致該結果的原因。不同植物在同一土壤上富集鉻含量也存在差異，已有研究報道了黑麥草（Lolium perenneL.）、高丹草（Sorghum bicolor(L.) Moench×S.Sudanense(Piper) Stapf）、狼尾草（Pennisetum alopecuroides(L.) Spreng）在土壤中，外源污染為100—300 mg·kg-1的條件下，最高富集含量大致分別為 4541、400、1090 mg·kg-1（喬云蕾等，2016）。

本研究的結果表明不同土壤間的毒性閾值、富集能力均差異顯著，導致這些差異的原因可能為土壤的物理化學性質影響了植物對污染物的攝取，進而左右了污染物的毒性效應。Mishra et al.（1995）、Srivastava et al.（1994）的研究報道過土壤作為植物的生長介質，對植物攝取鉻含量具有顯著影響，其試驗證明植物在土壤和沙土培養下對鉻的富集含量顯然不同。毒性閾值EC50被廣泛認為在評價土壤的毒性閾值時具有良好的穩定性（Smolder et al.，2009；宋文恩等，2014）。Lin et al.（2019）的研究基于跳蟲（Folsomia candida）活性為測試終點報道了鉻在對土壤中生物體的毒性閾值。其中老化22 d（與本實驗平衡時間相近）的河南和重慶土壤 EC50分別為22、41 mg·kg-1，這與本研究中重慶土壤具有高毒性閾值的結果相近，少許差異可能是小麥根長與跳蟲的物種敏感性差異所導致（丁楓華等，2018）。不同土壤中，同一測試終點評價得到的毒性效應差異較大（于修樂等，2018），而EC50值越低，該土壤Cr污染敏感性則越強，該類型土壤上生長的植物則更易遭受Cr污染的毒害。研究結果中，四川、河南、陜西以及河北土壤的 EC50（18.48—55.60 mg·kg-1）顯著低于重慶和新疆土壤（75.27—135.66 mg·kg-1），重慶、新疆土壤上植物鉻毒害的影響較小。

3.2 鉻有效性預測模型及價態分配

McLaughlin（2001）、Ma et al.（2006）的研究表明相同含量的重金屬在理化性質不同的土壤中的老化一段時間后，其有效態含量變化不同。在農田污染治理的實際應用中，用全量計算毒性閾值的方法準確性仍存在爭議，Ahmad et al.（2015）曾在其研究中表示用重金屬全量來衡量毒性效應的方法并不恰當，而化學提取態的含量變化一定程度上可以代表有效態含量變化（Paula et al.，2015）。Ding et al.（2014）利用提取態鉻含量，建立了基于胡蘿卜為毒性測試終點的鉻預測模型，而肖文丹（2014）則在 2014年建立了基于白菜、水稻為測試終點的鉻預測模型。本研究也將提取態鉻作為重要的預測因子，卻未直接將土壤理化性質作為模型預測因子，因為考慮到土壤理化性質影響提取態總鉻含量，不適宜將其與提取態總鉻含量同時作為預測因子。本研究基于實測的提取態總鉻含量及其價態分配，建立了新的預測模型，可以根據實測提取態含量預測植物毒性。模型以小麥相對根長作為因變量，自變量為提取態總鉻含量、Cr(VI)與Cr(III)占總鉻比值。相比前人的研究，該模型在實際應用中減少了需要測定的 pH值、陽離子交換量、有機質含量等土壤理化性質參數。Cr(VI)與Cr(III)分別與小麥相對根伸長呈現正相關和負相關。這是因為在提取態總鉻恒定的情況下，Cr(VI)含量越多則Cr(III)含量相對少，毒性效應越強，而Cr(III)含量相對多時，毒性較小。價態分配的結果表明高Cr污染下，陜西土壤P6高于重慶土壤，河北土壤P6與重慶相近，但陜西、河北土壤Cr(III)和Cr(VI)含量均顯著高于重慶土壤。顯然，重慶土壤上的植物鉻毒害要低于陜西河北土壤，且重慶土壤具有高毒性閾值，同處理下毒性閾值越高越不容易受重金屬毒害。

提取態鉻價態分布的差異也是導致土壤間毒性差異的重要原因，因為Cr(VI)和Cr(III)在土壤中分別被吸附固定且可以同時發生氧化還原過程。這些過程受到pH值、有機質含量、陽離子交換能力、鐵錳氧化物含量等多種理化性質的共同影響（Dhal et al.，2013）。比如，Cr(VI)在土壤礦物中的滯留量與土壤中磷、鐵含量相關（Gu et al.，2017），而高含量的鐵氧化物和鋁氧化物會促進Cr(VI)吸附過程（Jiang，2008；Pérez et al.，2014）。pH低的土壤中Cr(VI)更容易被吸附固定，且 Cr(VI)更容易還原成Cr(III)（Yang et al.，2019）。有機質豐富的土壤中Cr(VI)傾向于轉化為 Cr(III)（Banks et al.，2006），而錳氧化物則會促進 Cr(III)氧化成 Cr(VI)（Stepniewska et al.，2004）。土壤理化性質對Cr(III)的固定也有不同影響，其中，CEC含量高的土壤對Cr(III)的吸附更強（Cao et al.，2011），而低pH值的土壤中Cr(III)吸附能力遠遠弱于Cr(VI)。綜上所述，土壤間鉻毒性差異是由多種土壤理化性質綜合作用所致。重慶土壤由于低pH值、高有機質含量等理化性質因素導致Cr(VI)含量低，在6種土壤中鉻毒害最輕。如何區分各種土壤理化性質具體作用力度或貢獻度是本研究的尚未解決的科學問題，這也是評估鉻在土壤污染中危害的重要部分。在后續的研究中，我們將重點關注該問題。

4 結論

（1）在5—175 mg·kg-1土壤鉻質量濃度范圍內，小麥鉻富集系數隨著土壤鉻含量的增加而降低。不同土壤上小麥鉻富集系數以及毒性作用差異較大，而當小麥富集含量在高于200 mg·kg-1時，各土壤上小麥正常生長代謝均受到抑制。土壤理化性質的差異會導致有效態 Cr(VI)、Cr(III)含量差異，從而影響小麥對鉻的吸收積累，導致小麥鉻毒性效應不同。

（2）提取態鉻比土壤全量鉻更適宜預測鉻的有效性，而Cr(VI)與Cr(III)的毒害效應需要進行區分。于是，本研究基于提取態鉻含量及其價態分配建立了可以預測鉻有效性的模型。相比利用各種土壤基本理化性質為因子的預測模型，該模型直接用提取態實測值，具有預測因子測定簡便，測定參數少等優勢。

（3）Cr(VI)毒性遠遠高于Cr(III)，而土壤中鉻的價態分布受土壤理化性質影響，故導致了鉻毒性效應的差異。低pH值使得Cr(VI)更容易被吸附，高有機質使得Cr(VI)易還原成Cr(III)，故pH值低且有機質含量高的重慶土壤在6種農田土壤中鉻毒害最輕。