植物誘導型啟動子Prd29A的順式元件分析及應用研究進展

田港 韋丁一 許本波

摘 要：植物在生長發育過程中會遭受各種生物和非生物脅迫，對植物生長發育造成巨大的影響。植物基因工程中組成型啟動子應用存在種種弊端，因此對植物新型誘導型啟動子的開發應用成為了植物基因工程的研究熱點。該文從擬南芥中PAtrd29A啟動子序列結構以及應用出發，概述了該啟動子的脅迫誘導激活功能以及其給植物育種帶來的影響，開發應用這類新型誘導型啟動子是植物抵抗生長過程中非生物脅迫的有效措施。

關鍵詞：誘導型啟動子;順式元件;非生物脅迫

中圖分類號 Q943.2 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2020）24-0032-05

Advances in Cis-element Analysis and Application of Plant Inducible Promoter Prd29A

TIAN Gang et al.

（College of Life Science，Yangtze University， Jingzhou 434025， China）

Abstract：Plants suffer a variety of abiotic and biotic stresses in the process of growth and development，which causes great loss to plant growth. There are many disadvantages in the application of constitutive promoters in plant genetic engineering，so it is necessary to develop and apply new inducible promoters in plant genetic engineering. Based on the structure and application of the sequence of promoters PAtrd29A in Arabidopsis thaliana，the stress-induced and activated functions of the promoters and the significant impact of the promoters on plant breeding were reviewed in this paper. The development and application of the new type of promoters is an effective measure for plants to resist non-biological stress during growth.

Key word：Inducible promoter;Cis-elements;Abiotic stress

在植物生長過程中，非生物脅迫主要包括干旱、極端溫度、重金屬毒害、鹽堿以及澇漬等，嚴重影響植物的生長發育，由環境脅迫引起的農業破壞已成為世界范圍的問題[1，2]。在脅迫條件下，植物的形態、生理、生化及分子均會產生變化，植物細胞衰老死亡速度加快，為植物的生長和生產力帶來了不利影響，對農業發展以及自然環境構成了嚴重威脅。

植物在受到外界環境脅迫的刺激時會做出一系列的脅迫應答反應，其中，由局部脅迫引起的系統響應廣泛存在[3]，植物通過對自身激素水平的調節來適應極端環境的過程被稱為植物脅迫應答，而植物的激素水平通過其體內龐大的基因關系網絡調控。一些與脅迫響應相關的表達基因以及轉錄因子在不同環境條件下表現出差異的轉錄水平，這個過程可分為信號感知、信號轉導、基因激活及生化改變[4]。植物首先通過受體在細胞膜上感知到壓力，然后產生次級信使，如鈣和磷酸肌醇[5]。次級信使調節細胞內鈣水平，這種鈣水平變化由鈣結合蛋白（Ca2+傳感器）感測得到，隨后該蛋白啟動了磷酸化級聯反應，最終導致基因表達改變[6，7]，從而造成了激素以及一些蛋白激酶水平的差異。位于基因上游5′的啟動子是這些基因轉錄激活的開關，啟動子上面包含多種重要的順勢作用元件，它們能夠通過活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準確的結合從而激發或抑制基因的轉錄[8]。啟動子有多種分類，其中誘導型啟動子能夠在特定的環境條件誘導下激活下游基因的轉錄，從而影響植株的一些生理功能，以應對惡劣環境帶來的傷害。

1 誘導啟動子Prd29A及調控基因進化分析

YAMAGUCHI- SHINOZAK[9]等首次從擬南芥中分離并且克隆出了脅迫誘導相關基因rd29A（也稱為LTI78和COR78），它位于擬南芥5號染色體上，含711個氨基酸，預測分子量為7.8kd，由2個串聯重復序列組成的112個氨基酸的多肽存在于rd29A的中間;在rd29A的C端區域中存在21個氨基酸的第2個串聯重復序列，N端區域發現2個酸性區域和堿性區域[10]。經實驗證明，在多種脅迫處理下，rd29A啟動子均表現出強烈的誘導活性[11]。

目前，僅從擬南芥（Arabidopsis thaliana）和結縷草粳稻（Zoysia japonica）中克隆得到rd29A啟動子序列[12]。對rd29A基因序列進行進化分析（圖1）發現，擬南芥（Arabidopsis thaliana）基因序列Atrd29A和琴葉鼠耳芥基因（Arabidopsis lyrata subsp.lyrata）AlLTI78親緣關系最近，為91.68%，AlLTI78為低溫誘導脅迫響應因子;與薺菜基因（Capsella rubella）CrLTI78同源性為83.45%;與亞麻薺基因（Camelina sativa）CsLTI78同源性為82.71%;與樺木基因（Boechera divaricarpa isolate）BdiAD-C1同源性為82.53%;擬南芥同家族基因Atrd29B也是一個RD29脅迫相關基因，它與Atrd29A串聯在同一條有義鏈上，這2個基因在相同位置含有3個內含子[13]，Atrd29A基因與Atrd29B同源性為82.66%，據報道，這些同源基因都是與各種脅迫調控相關的轉錄因子[12，14]。YAMAGUCHI-SHINOZAKI[13]等研究發現，擬南芥中的Atrd29A基因與多種脅迫應激相關，Atrd29A啟動子對下游報告基因GUS表達活性的組織化學分析表明，rd29A啟動子在缺水期間幾乎在營養植物的所有器官和組織中起作用，其誘導活性甚至強于組成型啟動子Camv35S。因此，對基因rd29A啟動子的開發應用對培育抗逆植物新品種具有非常重要的生物學意義。

2 Prd29A啟動子的順式元件分析

順式作用元件是啟動子序列上一段含有5～20個堿基對的短序列，是非常重要的分子開關，決定了啟動子特異的轉錄激活功能的核心區域[15]。不同的順式元件有著不同的激活功能，參與應激反應的順式作用元件分別參與不同的脅迫相關基因調控通路，它們能與特定的轉錄信號因子結合，從而對下游基因在時間和空間上進行精細水平的調控，促進或抑制下游基因的轉錄。許多基因是由各種各樣的脅迫環境誘導表達的，這表明在這些應激信號通路之間存在串聯關系，誘導型啟動子通過自身的順式作用元件與其他的反式轉錄因子相互作用，并且在轉錄起始位點的上游的TATA盒（核心啟動子）形成轉錄起始復合體，然后轉錄起始復合物激活RNA聚合酶對應激因子起始轉錄，從而驅動了外源基因在脅迫環境下的高水平表達[16]。

從NCBI上找到Atrd29A啟動子序列以及其他各同源序列上游800bp左右啟動子序列，利用PLANTCARE分析順式元件，TBtools做可視化分析（圖2），保守基序在圖2中用圓圈標出。比較分析發現，在rd29A基因啟動子的順式元件中都存在保守的ABRE和ARE等脫落酸（ABA）響應元件。Marcotte[17]等利用缺失分析研究小麥Em基因啟動子，鑒定得到ABRE，研究發現，保守序列ABREs（PyACGTGGC）在許多ABA響應基因表達中是主要的作用元件[18，19]，許多干旱和寒冷誘導基因的啟動子中都包含ABREs基序，ABRE序列經常和其他元件協同作用參與ABA響應基因的轉錄。ABA作為一種在植物組織適應干旱和高鹽度等非生物脅迫以及種子的成熟和休眠都起著重要作用的植物激素，在ABA激素調控下，植株根系伸長、氣孔關閉，緩解了因高鹽分、干旱造成的脫水死亡，ABA還能誘導一些寒冷相關基因的表達，各種產物蛋白酶和激素水平的變化共同構成了植物的冷馴化過程[20]。除此之外，rd29A基因啟動子上還存在保守的DRE（TACCGACAT）響應元件，這是一類與多種脅迫相關的啟動子基序，參與干旱、低溫或高鹽脅迫誘導RD29A[21]。將整個DRE及其核心序列與不同植物中的其他脅迫誘導基因進行了比較，發現DRE順式元件（或其核心序列）非常保守，并且在干旱響應的植物基因中廣泛發現同時參與了鹽和冷害脅迫[22，23]。

YAMAGUCHI-SHINOZAK[13]等分別對擬南芥植物進行干旱和外源ABA處理，發現Atrd29A基因分別存在一條ABA響應的脅迫應答途徑和獨立于ABA的應答響應途徑，這與這2種順式元件的調控有關，并且2種途徑互相串擾，共同形成了啟動子的誘導激活活性。在PAtrd29A啟動子上存在2個DRE順式元件，這可能是造成其轉錄激活活性強于其他轉錄激活啟動子的原因。同時，CGTCA-motif也是Prd29A一個較為保守的順式作用元件，參與茉莉酸調控途徑;Patrd29A上還存在較為保守的AuxRR-motif，參與長素響應調控途徑。Prd29A還含有一些MYB響應元件以及多個啟動子核心元件TATA盒和CAAT盒，在這些順式元件的共同作用下，Prd29A表現出僅在脅迫誘導條件的轉錄激活活性[24，25]，被認為是一個脅迫誘導型啟動子。

3 Prd29A啟動子在植物基因工程的應用

3.1 Prd29A啟動子在耐旱基因工程中的應用 干旱是導致作物減產最主要的環境因素，在干旱條件下，細胞脫水造成植物組織失去正常生理功能，植株難以生存。傳統的育種方法可以得到抗旱植株，但是育種周期長、效率低，用分子生物學技術手段通過品種改良提高植株抗旱能力，有效地解決了傳統育種周期長和效率低的問題，對于國家農業穩定發展的意義深遠。柳娜[26]等通過轉化PRD29：DREB1A到小麥中培育出了抗旱性強的融合基因小麥，結果表明，轉基因小麥的過氧化物酶、氧化氫酶和超氧化物歧化酶在干旱脅迫下表現出了更強的活性，說明轉基因小麥在干旱脅迫下具有更強的清除活性氧的能力，抵抗因干旱帶來的加速衰老甚至死亡;2013年，Li F[27]等研究發現，構建組成型啟動子表達載體35S：EXPB23轉化煙草，得到的轉基因植株出現嚴重的發育遲緩表型，PRD29A：EXPB23轉化植株表型明顯改善，并且抗旱能力增強;Amanda Alves de Paiva Rolla[28]等用Prd29A：AtDREB1A轉化大豆培育對于溫室和田間耐寒的新品種;Li Z N[29]等用30%的PEG分別處理35S-：AtCDPK1和Prd29A：AtCDPK1轉基因馬鈴薯發現，由Prd29A啟動子調控的轉基因植株中，CDPK1基因在干旱壓力脅迫下的表達量顯著提高，然而35S在壓力處理瞎與正常生長的植株并沒有顯著差異，形態學觀察表明，Prd29A：AtCDPK1轉基因植株在脅迫處理后仍可以正常生長，優于非轉基因植株;吳瓊[30]等通過遺傳轉化PRD29A：AVP1表達盒獲得了抗旱性增強的匍匐翦股穎，表現出明顯的發達根系表型，對土壤中水分和養分的吸收能力顯著提高。

3.2 Prd29A啟動子在耐寒基因工程中應用 植物在生長過程中由寒冷帶來的損傷是重要的非生物脅迫之一，特別是對于油菜、小麥、韭菜等越冬作物而言，最適生長溫度是0℃以上的低溫不結冰。在我國北方冬季，凍害是造成植株死亡、農作物大量減產的主要原因，另外低溫還限制了植物的時空分布[31]，因此，培育耐寒的優良作物品種是解決低溫影響的有效手段。王北艷[32]等構建了Prd29A啟動子調控的ICE1基因的植物超表達載體，對粳稻品種空育131進行遺傳轉化發現，在寒冷脅迫處理下，大多野生型植株發生葉面卷曲、萎蔫、植株倒伏等致死表型，而轉基因株系T1-16和T1-24的脯氨酸含量顯著升高，基本都能恢復生長，表現出明顯的抗寒表型，存活率顯著高于對照;María Teresa Pino[33]等在對馬鈴薯低溫脅迫研究中發現，由Camv35S啟動子驅動AtCBF的轉基因植株的抗凍性并沒有明顯增強，依舊表現出小葉、黃葉、延遲開花以及塊莖減少或缺乏等表型，而Prd29A：AtCBF轉基因植株在暴露于低溫的幾個小時就超過了35S：AtCBF的抗凍水平，并且降低了正常狀態下的負面表型;賈海燕[34]等通過構建Prd29A：DREB1B表達載體分別轉化了康乃馨、雛菊、三色堇、矮牽牛等多種花卉植物，培育出新型的抗逆花卉品種，擴大了花卉的種植范圍和時間，延長了開花季節，在很大程度上提高了這些觀賞植物的經濟價值，為以后在寒冬中看到花朵綻放增加了更多的可能性。

3.3 Prd29A啟動子在耐鹽堿基因工程中應用 土壤鹽堿化是全球性土地荒漠化的主要表現形式之一。在自然和人類活動的不斷干擾下，受鹽漬化影響的土地面積不斷增加，嚴重制約了農業發展，對生態安全造成威脅[35]。鹽脅迫可能會誘導植株發生一系列生理生化的改變，滲透壓的改變直接影響了細胞膜的完整性和各種酶的活性。Qiu W[36]等研究發現，煙草中Prd29A：IPT基因的轉化延遲了鹽脅迫下葉片的衰老，提高了植株的抗氧化酶（POD、SOD等）活性和葉綠素、丙二醛（MDA）的含量，表現出更強的耐鹽能力;JINGJIANG[37]等構建表達載體Prd29A：codA，轉化煙草得到轉基因植株，在NaCl脅迫誘導下，所有的轉基因煙草植株均表現出比對照更高的鹽度耐受能力，與野生型相比，轉基因植株表現出明顯的葉色差異、抗氧化酶活性增加，有效賦予了煙草植株的脅迫耐受性;Jin T[38]等通過遺傳轉化Prd29A：GmDREB1引入苜蓿植物中，轉基因植株中與鹽堿脅迫相關的代謝物D1-吡咯啉-5-羧酸合酶（P5CS）基因轉錄水平顯著上調，這表明轉基因植株的應激誘導表達賦予了苜蓿更強的耐鹽能力，這些具有高耐鹽性的轉基因品系在飼草育種中具有重要的意義。

4 展望

逆境一直是全世界研究人員們致力解決的難題，為了提高植物的抗逆性，與傳統的雜交育種策略相比，通過基因工程的手段直接導入外源基因是一種更簡單快捷的解決方法。植物響應不同的環境脅迫條件時會表現出不同的基因轉錄水平，其在代謝和生理方面也會表現出特定的變化。通過開發利用新型啟動子與抗逆相關基因的表達盒，能夠很大程度提高植物的應激響應能力。但是我們對于誘導型啟動子的研究相對于組成型啟動子來說起步較晚[39]，先前的植物轉基因工程中用到最多的就是CaMV花椰菜花葉病毒的35S啟動子[40]，在各項研究中發現，這種組成型啟動子在普通條件下也能驅動一些外源脅迫相關基因的表達，可能會造成大量的基因功能冗余，還會導致基因之間因為競爭關系帶來的資源浪費，甚至可能直接影響了轉化植株的正常生長，所以轉化植株中經常會出現矮莖、葉片卷曲、發黃等負面表型[41]，而誘導型啟動子Prd29A正好彌補了這些不足，在未受到脅迫條件下它并不會表現出轉錄激活活性，只有在干旱、寒冷、鹽堿等非生物逆境中才會驅動下游基因的轉錄，這在能夠保證植物抗逆性提高的同時把副作用最小化。

目前，對于抗脅迫相關啟動子的開發及應用已成為植物基因工程的研究熱點，但是對于各類脅迫相關調控元件以及新的保守功能基序的發現還需要進一步探索[42]。由于植物應激響應調控網絡相當復雜，還有很多脅迫誘導轉錄因子還并未被人們發現，植物在受到脅迫信號時是如何將這些信號在復雜的調控網絡中傳遞的，如何引起植物通過各種代謝物水平的變化應答極端環境的，如何把這類誘導型啟動子應用到非生物脅迫應答中，這些都需要更加深入的研究。利用這些生物技術手段培育優良的耐逆作物品種，對于加快我國農業經濟的高速發展意義重大。

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（責編：張宏民）