新鮮山藥提取物對小鼠胃潰瘍的預防作用研究

金佳熹，周冰玉，李柳蓉，馮青秀，柯春嬌，覃海音，農雪娟，趙 爽

(右江民族醫(yī)學院，廣西 百色 533000)

胃潰瘍(gastric ulcer，GU)是一種臨床常見的消化道疾病，患病率可達10%左右，主要癥狀為上腹疼痛、多表現(xiàn)為劍突下痛、呈隱痛、鈍痛、脹痛、燒灼痛，更是具有1%～3%的癌變率，臨床治療困難且患者個人十分痛苦[1]。“山藥”是薯蕷的塊莖，祖國四大懷藥之一，目前認為山藥中的有效成分多糖是其主要活性成分并存在于山藥黏液質中[2-5]。近年研究顯示，山藥可促進細胞免疫和體液免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用，影響胃腸動力學，還可抗衰老及降血糖等。本研究通過計算新鮮山藥提取物對胃潰瘍小鼠潰瘍指數(shù)、觀察黏膜形態(tài)結構，及測量血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、一氧化氮(Nitric Oxide，NO)表達的變化，探究新鮮山藥提取物在防治胃潰瘍過程中的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

普通級KM小鼠100只，9周齡，右江民族醫(yī)學院動物實驗中心買進[SCXK(桂)2017-0003]，小鼠體質量25～30 g，雌雄各半。動物飼養(yǎng)于動物實驗房，室溫22℃～24℃，相對濕度50%～70%，光線為12 h明暗循環(huán)。使用小鼠標準飼料喂養(yǎng)，自由飲水。小鼠的血液取材等實驗操作在右江民族醫(yī)學院機能實驗中心[SYXK(桂)2018-0006]。完成。本實驗所涉及的所有動物實驗均已經(jīng)右江民族醫(yī)學院倫理委員會審核批準(倫理審查證號2017050101)，嚴格執(zhí)行實驗動物安全等相關規(guī)定。嚴格遵守動物使用的3R原則，實驗整個過程均給予實驗小鼠以人道主義關懷。

1.2 主要試劑與儀器

消炎痛(購自Sigma公司)；新鮮山藥(購自菜市)；施維舒膠囊(購自蘇州衛(wèi)材制藥有限公司)；血清MDA(批號：20171019)、NO(批號：20171019)、SOD(批號：20180511)和GSH-Px(批號：20180511)活性檢測試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)；其余生物與生化試劑分析純(購自國藥集團化學試劑有限公司)；UV-1700紫外可見分光光度計(購自上海精密科學儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 鮮山藥提取物制備

挑選粗細長短相同、橫切面雪白色、外皮無損傷的新鮮瘦長山藥為原料。將山藥洗凈、去皮并切成大小均等的小塊。用大功率食品打漿機打漿。實驗高劑量組為鮮山藥勻漿加1/3倍體積雙蒸水，實驗低劑量組為鮮山藥勻漿加3倍體積雙蒸水，相當于高劑量組濃度為0.75 g/mL，低劑量組的濃度為0.25 g/mL。將配備好的山藥勻漿充分攪拌用于灌胃。

1.3.2 動物分組和模型制備

全部實驗用小鼠隨機分成5組：空白對照組、模型組、施維舒組、鮮山藥提取物高劑量組、鮮山藥提取物低劑量組，每組20只，雌雄各半。用消炎痛一次灌胃法，化學點燃小鼠急性胃潰瘍模型。空白對照組和模型組灌胃等體積生理鹽水，施維舒組灌胃濃度為2.0 mg/mL施維舒溶液，鮮山藥提取物高劑量組、低劑量組分別灌胃濃度為0.75 g/mL、0.25 g/mL鮮山藥提取物，灌胃量為10 mL/kg體重。每只每日灌胃1次，連續(xù)灌胃45 d。之后對除空白對照組外的其他4組用消炎痛(2.5 mg/mL)進行一次性灌胃建立胃潰瘍模型，7 h后處死全部小鼠。取血檢測血清SOD、GSH-Px活性及NO、MDA蛋白表達。

1.3.3 胃潰瘍指數(shù)測定及潰瘍抑制率計算

解剖小鼠取胃組織，沿胃大彎全部剪開，用生理鹽水漂洗胃組織內部黏膜，之后將其平鋪濾紙上吸干水分，最后展平在固定板上用細針頭沿邊緣固定，觀察潰瘍的情況。采用Guth標準計算潰瘍指數(shù)(潰瘍面積)：病變的最大徑<1 mm為1分；1～2 mm為2分；2～4 mm為3分；>4 mm為4分；若病灶寬于2 mm，其長度乘以2。每只小鼠的潰瘍指數(shù)為此小鼠全胃出現(xiàn)總病灶之和的評分。胃潰瘍抑制率=[(模型組大鼠胃潰瘍指數(shù)-給藥組大鼠胃潰瘍指數(shù))/模型組大鼠胃潰瘍指數(shù)]×100%。

1.3.4 胃黏膜組織HE染色

于福爾馬林中固定完成后進行石蠟包埋，對胃組織潰瘍面進行組織病理切片，厚度4 μm，脫蠟，蘇木精-伊紅(HE)染色，在顯微鏡放大100倍視野下觀察其細胞和組織的形態(tài)結構變化。它是現(xiàn)階段臨床醫(yī)學領域一種重要的診斷方法，對疾病的后續(xù)治療方案構建提供了重要依據(jù)，是疾病診斷金標準。

1.3.5 檢測血清SOD、GSH-Px活性及NO、MDA蛋白表達

動物處死后取小鼠血液靜置，4℃下以離心半徑13.5 cm、4000 r/min離心10 min，取上清液。檢測SOD含量(黃嘌呤氧化法)，檢測GSH-Px活性(硫代巴比妥酸法)，檢測NO、MDA含量(紫外分光光度法)，所有實驗檢測步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

表1 各組胃潰瘍指數(shù)和潰瘍抑制率比較

注：與空白對照組比較，＊P<0.01；與模型組比較，#P<0.05；與施維舒陽性組比，**P<0.05，下表同。

Note. Compared with the control group,＊P<0.01. Compared with the Model group,#P<0.05. Compared with the Selbex see teprenone group,**P<0.05. The same in the following tables.

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 測定胃潰瘍指數(shù)、計算潰瘍抑制率

空白對照組大鼠的胃黏膜肉眼觀察見表面光滑，淡粉色，有黏膜皺襞，無充血、出血現(xiàn)象。模型組小鼠胃腔黏膜表面有彌漫性水腫，內表面出現(xiàn)咖啡樣物質，經(jīng)生理鹽水緩慢沖洗后見廣泛分布的出血點及條索狀、點狀深褐色潰瘍，胃體胃潰瘍指數(shù)達到(5.73±1.83) mm2，胃潰瘍動物模型點燃成功。如圖1～圖2。經(jīng)過施維舒陽性藥物處理后可顯著減輕胃潰瘍，病變潰瘍指數(shù)僅為(1.27±0.38) mm2。新鮮山藥提取物預防給藥可使小鼠胃潰瘍面積降低(P<0.05)，其中高濃度山藥提取物組胃潰瘍抑制率接近陽性藥施維舒組。結果見表1。

圖1 正常對照組胃黏膜內壁Figure 1 Inner wall of the gastric mucosa in the normal control group

注：箭頭所示為潰瘍出血。圖2 潰瘍模型組胃黏膜內壁Note. The arrow indicates ulcerative hemorrhaging.Figure 2 Inner wall of the gastric mucosa in the ulcer model group

2.2 胃黏膜組織HE染色

模型組胃黏膜組織炎細胞浸潤及腺體破壞程度十分嚴重，而施維舒作為廣泛使用的抗胃潰瘍藥品其預防胃潰瘍作用效果顯著，經(jīng)施維舒預防給藥過的胃組織黏膜與正常對照組形態(tài)差異不大。長期服用高濃度山藥的小鼠其胃組織黏膜炎細胞浸潤及腺體破壞程度較輕，與施維舒治療組小鼠胃組織差異不大；山藥低濃度組對胃潰瘍的預防作用不是很明顯，其組織的炎細胞浸潤及腺體破壞程度比較嚴重。結果見圖3。

2.3 血清MDA、SOD、NO、GSH-Px蛋白表達

整理結果后發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠血清中SOD、GSH-Px活性下降，MDA、NO含量增加，相應的潰瘍指數(shù)也普遍增加，而新鮮山藥提取物組小鼠血清MDA、NO含量降低，SOD、GSH-Px活性升高(P<0.05)。長期灌胃0.75 g/mL的高濃度山藥提取物可以顯著提高血清SOD的活性，鮮山藥提取物在0.25 g/mL的劑量下血清SOD活性也有升高，且顯示出了一定的量效關系。高劑量的鮮山藥提取物在預防和抑制消炎痛所致的小鼠急性胃潰瘍中具有一定作用。山藥高濃度給藥對小鼠胃潰瘍這一疾病的預防效果最佳，與施維舒藥物的效果相近，但是低濃度山藥的預防效果相比之下不顯著，有待進一步深入研究。結果見表2～表5。

組別Groups用藥劑量(g/kg)DoseSOD(U/mL)空白對照組Control group—33.74±1.97模型組Model group—7.63±2.12*施維舒陽性組Teprenone group0.0231.57±1.87#山藥高濃度組High dose of fresh yam extract7.521.67±2.22#**山藥低濃度組Low dose of fresh yam extract2.514.72±2.32#**

表3 新鮮山藥提取物對血清MDA表達的影響

表4 新鮮山藥提取物對血清GSH-Px活力的影響

表5 新鮮山藥提取物對血清NO含量的影響

3 討論

山藥主產于廣西、河北、河南等地，其性屬甘且溫和，具有多種生物活性，常食之可以強身健體、延緩衰老、補脾胃虧損[6-7]。目前研究顯示，山藥具有增加胃黏膜堿性成纖維細胞生長因子受體[8]、血清表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)表達及降低血清胃泌素含量的作用[9]。

近年臨床研究表明氧化應激損傷和炎癥反應已成為急性胃潰瘍的重要誘導因素。從大量醫(yī)學報道我們得知消炎痛誘導的氧化應激損傷不僅會破壞胃粘膜層、破壞為防御系統(tǒng)，嚴重的潰瘍甚至可能通過破壞氧化還原敏感的轉錄因子，從而加重機體炎癥反應[10]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展，其藥物治療在一定程度上能夠控制癥狀，但同時服用藥物又可能引發(fā)肝腎等不良反應，進一步加劇胃的負擔，因此探究天然具有胃潰瘍保護作用的食物是一條較為適當?shù)耐緩剑幨惩吹纳剿幘湍軌蛱峁┤藗內粘ｏ嬍撑c良好保健功效的需要。

本實驗以2.5 mg/mL消炎痛一次灌胃建立急性小鼠胃潰瘍模型，最先觀察到模型組小鼠出現(xiàn)步履慌張、精神萎靡不振癥狀。同時測量其潰瘍抑制率顯著下降，導致部分組織出現(xiàn)氧化應激現(xiàn)象[11-13]。SOD和GSH-Px為重要的抗氧化酶，胃組織氧化產生的過氧化物被SOD和GSH-Px還原后，被轉換為毒害較低或無害成分，從而利于胃潰瘍造成黏膜損傷的恢復。本實驗結果顯示，藥物新鮮山藥提取物可通過增強動物體內氧自由基清除酶SOD的活性[9,14-19]，降低氧自由基的含量，從而降低胃潰瘍損傷，促進胃黏膜的愈合。GSH-Px是催化還原型谷胱甘肽(GSH)氧化的主要酶之一。能夠催化還原型谷胱甘肽與ROS反應，后特異性生成氧化型谷胱甘肽GSSG，以此機制保護生物膜免受ROS的損害。從實驗結果看出，與模型組相比，山藥高劑量組GSH-Px含量增高(P<0.05)，說明新鮮山藥提取物確實具有一定的胃潰瘍預防作用。

NO是具有多種生物學活性的自由基氣體分子。適度的NO可舒張血管，維持胃黏膜上皮完整性，增加胃黏膜血流量，且研究表明NO可保護胃黏膜細胞，降低損傷易感性[20-21]。然而疾病情況下所產生的大量NO可與氧自由基結合生成過氧化亞硝酸離子(ONOO-)，使細胞脂質發(fā)生過氧化反應，引起炎性損傷[22]。MDA是氧化應激的標志物，胃組織發(fā)生損傷后會大量生成，使得氧化與抗氧化平衡體系被打破，局部氧化應激加劇，可作為判斷胃潰瘍的指標[23-24]，而新鮮山藥提取物可顯著抑制消炎痛處理所致的小鼠血清MDA含量增加(P<0.05)。

病理診斷是現(xiàn)階段臨床醫(yī)學領域一種重要的診斷方法，對疾病的后續(xù)治療方案構建提供了重要依據(jù)，是疾病診斷金標準[7]。在5組HE染色圖片的對比中，可見模型組胃組織炎細胞浸潤及腺體破壞程度十分嚴重，而施維舒作為廣泛使用的抗胃潰瘍藥品其預防胃潰瘍作用效果顯著，經(jīng)預防給藥過的胃組織與正常組差異不明顯。長期服用高濃度山藥的小鼠其胃組織炎細胞浸潤及腺體破壞程度較輕，與施維舒治療組小鼠胃組織形態(tài)結構差異不大，山藥低濃度組對胃潰瘍的預防作用效果不顯著，其組織的炎細胞浸潤及腺體破壞程度比較嚴重。由此得出結論，山藥高濃度給藥對小鼠胃潰瘍這一疾病的預防效果最佳，與施維舒藥物的效果相近，但是低濃度山藥的預防效果相比之下不顯著，有待進一步深入研究。鮮山藥提取物具有保護胃黏膜預防急性胃潰瘍的作用，其機制與降低MDA、NO因子表達，增加SOD、GSH-Px因子活力，發(fā)揮抗氧化應激作用有關。