miR-34a通過靶向SIRT1對MPP+誘導的帕金森病模型細胞凋亡和氧化應激損傷的影響①

劉金泉 孫永勝 劉春云

(山西大同大學神經病學與精神病學教研室，大同 037009 )

微小RNAs(miRNAs)是一類長度通常為22～30 nt的小分子RNA，通過降解靶基因或抑制靶基因翻譯調控轉錄后的基因表達，被證實在帕金森病(parkinson′s disease,PD)神經細胞凋亡和氧化應激等過程中發揮著重要作用[1-3]。1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)是一種可引起神經細胞氧化應激損傷和細胞凋亡的神經毒，常被作為帕金森病細胞模型的誘導劑[4，5]。近年來，有研究顯示，在MPP+誘導的帕金森病細胞模型中miR-34a表達上調，且miR-34a與PD神經細胞凋亡和氧化應激損傷密切相關[6，7]，但其具體的調控機制尚不完全清楚。沉默信息調控因子1(SIRT1)是一種組蛋白去乙酰化酶，具有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性脫乙酰酶活性，被認為在PD發病過程中具有神經保護的作用[8]。本研究通過生物信息學軟件預測發現，miR-34a與SIRT1 3′-非編碼區存在互補的核苷酸序列，猜測miR-34a可能通過靶向調控SIRT1表達影響PD神經細胞凋亡和氧化應激反應。因此，本研究以人神經母細胞瘤SH-SY5Y為研究對象，構建MPP+誘導的PD細胞模型，擬探討miR-34a低表達能否通過靶向SIRT1抑制MPP+誘導的SH-SY5Y細胞凋亡和氧化應激損傷。

1 材料與方法

1.1材料 人神經母細胞瘤株SH-SY5Y購于廣州中山大學細胞庫。兔抗人SIRT1和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體購于美國Santa Cruz公司，MPP+、噻唑藍(MTT)和二甲基亞砜購于美國Sigma公司，青鏈霉素混合液購于北京索萊寶公司，胎牛血清、胰蛋白酶和DMEM/F12培養基購于美國Gibco公司，乳酸脫氫酶(LDH)活性檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒和丙二醛(MDA)含量試劑盒購于南京建成有限公司，脂質體2000、Trizol試劑膜聯蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒和RT-PCR試劑盒購于美國Invitrogen公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒購于北京鼎國昌盛公司。miR-34a模擬物(5′-UGGCAGUGUCUUAGGU-GGUUGU-3′)、miR-34a抑制劑(5′-UGGCAGUGUCUUAGGUGGUUGU-3′)及其相應的陰性對照miR-NC(5′-UUCUCCGAACGUGU-CACGUTT-3′)和anti-miR-NC(5′-CAGUACUUUU-GUGUAGUACAA-3′)購于百奧邁科生物公司。熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于碧云天生物技術研究所。SIRT1干擾序列siSIRT1及其陰性對照序列siNC是由上海吉瑪公司設計合成。

1.2方法

1.2.1細胞培養 SH-SY5Y細胞以含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混液的DMEM/F12培養基于 5%CO2的37℃恒溫培養箱內常規培養。使用倒置顯微鏡定期觀察，2 d換一次培養液，待細胞鋪滿瓶底80%時，以1∶3比例加入胰蛋白酶消化傳代。采用生長狀況良好的第3代指數期細胞進行實驗。

1.2.2MPP+作用濃度的篩選 將指數期的SH-SY5Y細胞以每孔200 μl(濃度為6×104個/ml)種植于96孔細胞板上，置于細胞培養箱內常規培養12 h后，加入終濃度為500、1 000和2 000 μmol/L的MPP+，其中每個濃度設置5個平行孔。于培養箱內培養48 h后，棄培養液加入150 μl(濃度為0.5 mg/ml)的MTT溶液于培養箱內反應4 h。棄上清液后，加入二甲基亞砜150 μl振蕩反應10 min使MTT結晶充分溶解。采用酶標儀檢測各組細胞的吸光度值，檢測波長為490 nm，以對照組的百分比表示各組細胞活力。

1.2.3RT-PCR檢測miR-34a和SIRT1 mRNA的表達 將指數期的SH-SY5Y細胞按照每孔3×105個種植于6孔細胞板上，于培養箱內培養12 h后加入500、1 000和2 000 μmol/L濃度的MPP+作用48 h。收集各組細胞后，參照Trizol試劑說明書步驟提取細胞總RNA，將RNA逆轉錄合成cDNA后，根據上海生工生物合成的PCR引物(miR-34a F:5′-CCCACTCACCGTACTAA-3′，R:5′-GTGGTTTCAAGGCCAGATGT-3′；內參U6 F:5′-CTCGCTTCGGC-AGCACA-3′，R:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；SIRT1F:5′-TGAAAGTGATGAGGAGGATAGAGCC-3′，R:5′-CAACCTGTTCCAGCGTGTCTATGT-3′；內參GAPDH F:5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′，R:5′-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3′)將配制的25 μl反應體系(包含2 μl cDNA、SYRY Premix Ex TaqⅡ12.5 μl、上下引物各1 μl和ddH2O 8.5 μl)上PCR儀按照95℃ 預變性5 min，95℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃ 延伸30 s，共循環38次的反應條件進行擴增。2-ΔΔCt法計算各組細胞中miR-34a和SIRT1 mRNA的表達。實驗重復3次。

1.2.4Western blot檢測 收集不同濃度MPP+作用48 h后的各組細胞，加入細胞裂解液提取總蛋白，以BCA法定量。取沸水浴變性后的總蛋白樣品60 μg進行SDS-PAGE凝膠電泳分離。待分離結束后，轉至聚偏二氟乙烯膜上。經含5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉處理1 h后，加入SIRT1抗體(1∶500)和GAPDH抗體(1∶1 000)4℃下孵育24 h。以封閉液洗膜3次后，加入辣根過氧化酶標記山羊抗兔或抗鼠IgG的二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h。封閉液再次洗膜后，加入顯影液顯影，凝膠成像系統檢測。實驗重復3次。

1.2.5脂質體介導miR-34a過表達或低表達 將指數期的SH-SY5Y細胞以每孔105個種植于6孔細胞板上，置于培養箱內培養過夜。待細胞匯合度達70%時，參照脂質體2000轉染試劑說明書步驟將終濃度為20 nmol/L的miR-34a模擬物、miR-34a抑制劑及其相應的對照miR-NC和anti-miR-NC轉染至miR-34a組、anti-miR-34a組、miR-NC組和anti-miR-NC組中。待轉染48 h后，收集各組細胞分別采用RT-PCR檢測各組細胞中miR-34a、SIRT1 mRNA的表達，Western blot檢測SIRT1蛋白的表達。實驗重復3次。

1.2.6熒光素酶實驗檢測miR-34a與SIRT1的靶向關系 采用TargetscanHuman軟件預測發現SIRT1可能是miR-34a的潛在靶基因。為了驗證miR-34a和SIRT1是否存在靶向關系，將SIRT1的3′UTR片段克隆到psiCHECK-2熒光素酶載體上，作為SIRT1野生型(SIRT1-WT)載體；利用TaKaRa點突變試劑盒突變SIRT1 3′UTR和miR-34a的結合位點，再克隆到psiCHECK-2熒光素酶載體上，作為SIRT1突變型(SIRT1-MUT)載體。將指數期的SH-SY5Y細胞以每孔104個細胞種植于96孔細胞板上，將其分為miR-34a/anti-miR-34a+SIRT1-WT組、miR-NC/anti-miR-NC+SIRT1-WT組、miR-34a/anti-miR34a +SIRT1-MUT組和miR-NC/anti-miR-NC+SIRT1-MUT組。每組實驗設置3個重復。參照脂質體2000說明書先將miR-34a模擬物、miR-34a抑制劑及其陰性對照miR-NC和anti-miR-NC分別與SIRT1-WT、SIRT1-MUT共轉染至SH-SY5Y細胞中。待轉染48 h后，收集各組細胞并參照熒光素酶試劑盒說明書步驟檢測各組細胞的熒光素酶活性。實驗重復3次。

1.2.7凋亡實驗和氧化應激實驗分組及處理 實驗分為Control組：加入等量培養液；MPP+組：加入2 000 μmol/L MPP+；MPP++anti-miR-NC組：轉染miR-NC后給予2 000 μmol/L MPP+；MPP++anti-miR-34a組:轉染miR-34a抑制劑后給予2 000 μmol/L MPP+；MPP++anti-miR-34a+siNC組:共轉染miR-34a抑制劑和SIRT1干擾序列的陰性對照后，給予2 000 μmol/L MPP+；MPP++anti-miR-34a+siSIRT1組：共轉染miR-34a抑制劑和SIRT1干擾序列后，給予2 000 μmol/L MPP+。經MPP+作用48 h后，收集各組細胞采用流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率，試劑盒檢測細胞上清液中MDA含量和SOD、LDH活性。實驗重復3次。

1.2.8流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集MPP+處理48 h后的各組SH-SY5Y細胞，以預冷的磷酸緩沖液漂洗后，加入Binding buffer 100 μl重懸細胞，分別加入Annexin V-FITC 5 μl和PI 10 μl于避光條件下染色15 min后，再次加入Binding buffer 400 μl，1 h內上流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率。實驗重復3次。

1.2.9試劑盒檢測細胞上清液中MDA含量和SOD、LDH活性 收集MPP+處理48 h后的各組SH-SY5Y細胞上清液，分別參照LDH試劑盒、SOD試劑盒和MDA試劑盒說明書步驟檢測各組細胞上清液中LDH、SOD活性和MDA含量。實驗重復3次。

2 結果

2.1不同濃度MPP+對SH-SY5Y細胞存活及miR-34a和SIRT1表達的影響 不同濃度MPP+處理SH-SY5Y細胞后miR-34a表達升高而SIRT1表達降低，MPP+對SH-SY5Y細胞的損傷隨著MPP+作用濃度的增加而增大，表現出細胞存活率較對照組顯著降低(P<0.05)；同時，與對照組相比，不同濃度的MPP+可引起SH-SY5Y細胞中miR-34a表達升高，而SIRT1 mRNA和蛋白的表達水平降低(P<0.05)，且呈濃度依賴性。故后續選用2 000 μmol/L作為MPP+最佳損傷濃度。見圖1、表1。

圖1 Western blot檢測SIRT1蛋白的表達Fig.1 Detection of SIRT1 protein expression by Western blot

表1 MPP+對SH-SY5Y細胞存活率、miR-34a表達和SIRT1表達的影響

Tab.1 Effects of MPP+on SH-SY5Y cell survival rate,expression of miR-34a and SIRT1

GroupsCell survival rate(%)miR-34aSIRT1 mRNASIRT1 proteinControl97.08±7.521.01±0.081.00±0.060.80±0.07500 μmol/L MPP+85.16±5.051)1.46±0.121)0.72±0.041)0.48±0.041)1 000 μmol/L MPP+68.43±3.121)2.02±0.251)0.52±0.031)0.31±0.031)2 000 μmol/L MPP+43.08±3.251)2.75±0.281)0.35±0.021)0.18±0.021)F64.21341.811144.169110.603P0.0000.0000.0000.000

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;n=3.

2.2miR-34a靶向調控SIRT1的表達 圖2和表2結果顯示，與miR-NC組相比，在miR-34a過表達的miR-34a組中SIRT1 mRNA和蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)；而在miR-34a低表達的anti-miR-34a組中SIRT1 mRNA和蛋白的表達水平較anti-miR-NC組顯著升高(P<0.05)。

2.3雙熒光素酶報告實驗 TargetScan軟件預測結果顯示miR-34a與SIRT1 3′ UTR 存在互補的結合位點。采用熒光素酶實驗檢測發現，miR-34a過表達可降低SIRT1-WT質粒轉染的SH-SY5Y細胞的熒光素酶活性；而miR-34a低表達則升高SIRT1-WT質粒轉染的SH-SY5Y細胞的熒光素酶活性，與相應對照組相比差異均有統計學意義(P<0.05)；但miR-34a表達對SIRT1-MUT質粒轉染的SH-SY5Y細胞的熒光素酶活性無顯著影響。見表3、4。

圖2 Western blot檢測SIRT1蛋白的表達Fig.2 Detection of SIRT1 protein expression by Western blot

表2 miR-34a對SIRT1表達的影響

Tab.2 Effects of miR-34a on SIRT1 expression

GroupsmiR-34aSIRT1 mRNASIRT1 proteinmiR-NC1.00±0.08 0.59±0.040.79±0.06miR-34a3.85±0.131) 0.31±0.031)0.21±0.031)anti-miR-NC0.97±0.060.62±0.050.75±0.08anti-miR-34a0.24±0.022)1.22±0.072)1.18±0.092)F545.070177.818100.395P0.0000.0000.000

Note：Compared with the miR-NC group,1)P<0.05;compared with the anti-miR-NC group,2)P<0.05;n=3.

表3 SIRT13′ UTR與miR-34a的結合位點

Tab.3 Binding sites of SIRT1 3′UTR to miR-34a

GeneComplementary nucleotide sequencesBinding positionSIRT15′...AUCUUCACCACAAAUACUGCCAA...3′755-761 of SIRT1miR-34a3′...UGUUGGUCGAUUCUGUGACGGU...5′3′ UTR

2.4miR-34a低表達通過靶向SIRT1抑制MPP+誘導的SH-SY5Y細胞凋亡 圖3和表5結果顯示，與對照組相比，2 000 μmol/L MPP+處理后可引起miR-34a 表達和細胞凋亡率升高，而SIRT1 mRNA和蛋白表達降低(P<0.05)；與MPP+組相比，轉染miR-34a抑制劑的MPP++anti-miR-34a組中miR-34a表達和細胞凋亡率顯著降低，而SIRT1 mRNA和蛋白的表達顯著升高(P<0.05)；而轉染miR-34a抑制劑陰性對照的MPP++anti-miR-NC組與MPP+組間無顯著差異(P>0.05)。與MPP++anti-miR-34a+siNC組相比，轉染SIRT1干擾序列的MPP++anti-miR-34a+siSIRT1組細胞中SIRT1 mRNA和蛋白的表達顯著降低，而細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；另外，轉染無意義序列的MPP++anti-miR-34a+siNC組與MPP++anti-miR-34a+siNC組相比無顯著差異(P>0.05)。

表4 各組細胞的熒光素酶活性

Tab.4 Luciferase activity of cells in each group

GroupsLuciferase activitySIRT1-WTSIRT1-MUTmiR-NC1.03±0.081.01±0.07miR-34a0.37±0.041)1.03±0.09anti-miR-NC0.99±0.070.96±0.08anti-miR-34a2.46±0.182)0.98±0.07F207.4060.477P0.0000.707

Note：Compared with the miR-NC group,1)P<0.05;compared with the anti-miR-NC group,2)P<0.05;n=3.

圖3 miR-34a靶向SIRT1表達對MPP+ 誘導的SH-SY5Y細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of SIRT1 expression targeting by miR-34a on MPP+ induced SH-SY5Y cell apoptosisNote: A.Detection of SIRT1 protein expression by Western blot;B.Detection of apoptosis by flow cytometry.

表5 miR-34a靶向SIRT1表達對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞凋亡的影響

Tab.5 Effect of SIRT1 expression targeting by miR-34a on MPP+induced SH-SY5Y cell apoptosis

GroupsmiR-34aSIRT1 mRNASIRT1 proteinApoptotic rate(%)Control1.00±0.060.98±0.070.73±0.065.68±2.32MPP+2.68±0.211)0.33±0.031)0.17±0.031)24.54±3.661)MPP++anti-miR-NC2.70±0.231)0.34±0.031)0.12±0.021)22.86±3.151)MPP++anti-miR-34a1.39±0.131)2)0.58±0.041)2)0.43±0.031)2)13.45±1.121)2)MPP++anti-miR-34a+siNC1.36±0.111)2)0.56±0.041)2)0.47±0.041)2)12.96±1.051)2)MPP++anti-miR-34a+siSIRT11.41±0.121)2)0.32±0.021)3)0.15±0.021)3)19.78±1.321)2)3)F68.173113.691134.00827.960P0.0000.0000.0000.000

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the MPP+group,2)P<0.05;compared with the MPP++anti-miR-34a group,3)P<0.05;n=3.

表6 各組中LDH活性、SOD活性和MDA含量的比較

Tab.6 Comparison of LDH activity,SOD activity and MDA content in each group

GroupsLDH(U/ml)MDA(nmol/ml)SOD(U/mg prot)Control225.76±12.250.39±0.0614.22±0.12MPP+379.48±13.661)1.02±0.091)7.54±0.131)MPP++anti-miR-NC365.55±12.701)0.97±0.081)7.15±0.121)MPP++anti-miR-34a284.12±8.851)2)0.52±0.041)2)12.28±0.251)2)MPP++anti-miR-34a+siNC288.09±10.051)2)0.50±0.031)2)12.32±0.221)2)MPP++anti-miR-34a+siSIRT1329.45±11.321)2)3)0.74±0.051)2)3)10.06±0.181)2)3)F73.80453.735770.338P0.0000.0000.000

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the MPP+group,2)P<0.05;compared with the MPP++anti-miR-34a group,3)P<0.05;n=3.

2.5miR-34a低表達通過靶向SIRT1減輕MPP+誘導的SH-SY5Y細胞氧化應激損傷 表6結果顯示，與對照組相比，2 000 μmol/L MPP+處理SH-SY5Y細胞后，SH-SY5Y細胞上清液中MDA含量和LDH活性顯著升高，而SOD活性顯著降低(P<0.05)；與MPP+組相比，MPP++anti-miR-34a組中MDA含量和LDH活性顯著降低，而SOD活性顯著升高(P<0.05)；但是，MPP++anti-miR-NC組和MPP+組比較無顯著差異(P>0.05)。與MPP++anti-miR-34a組相比，MPP++anti-miR-34a+siSIRT1中MDA含量和LDH活性顯著升高，而SOD活性顯著降低(P<0.05)；然而，MPP++anti-miR-34a+siNC和MPP++anti-miR-34a組比較無顯著性差異(P>0.05)。

3 討論

本研究以500、1 000和2 000 μmol/L的MPP+作用于SH-SY5Y細胞后發現，細胞受到損傷，細胞存活率逐漸降低，同時miR-34a的表達逐漸升高，而SIRT1的表達逐漸降低。這提示miR-34a和SIRT1在MPP+誘導的SH-SY5Y細胞損傷過程中發揮著重要作用。本研究以2 000 μmol/L的MPP+作用后發現，SH-SY5Y細胞凋亡率顯著升高，且細胞上清液中氧化應激相關指標抗氧化酶SOD活性降低，而脂質過氧化物MDA含量、活細胞胞漿內酶LDH活性升高。結果表明，MPP+可誘導SH-SY5Y細胞的氧化應激損傷和細胞凋亡，帕金森病細胞模型構建成功。LDH活性大小可較好地反映出細胞膜的損傷程度；MDA含量的高低可間接反映機體遭受自由基攻擊的程度；SOD活力的高低可間接反映機體清除自由基的能力大小；三者常被作為反映細胞氧化應激的重要指標[9,10]。另外，本研究采用生物信息學軟件預測發現，SIRT 13′UTR存在與miR-34a互補的核苷酸序列，采用熒光素酶實驗證實SIRT1是miR-34a的靶基因，同時RT-PCR和Western blot檢測發現miR-34a可負向調控SIRT1 mRNA和蛋白的表達。這表明miR-34a可靶向調控SIRT1的表達，該結果與陳薊等[11]得到的miR-34a與SIRT1存在靶向關系的結果相似。

PD是一種常見的神經退行性疾病，以黑質多巴胺神經元的缺失為主要病理改變，出現運動遲緩、肌肉僵直、姿勢反射障礙等其常見的臨床表現；目前，關于PD的發病機制尚不明確，但越來越多的研究證實神經元細胞凋亡和氧化應激引起的細胞損傷是PD發病的重要機制[12-14]。因此，尋找有效抑制PD神經細胞凋亡和氧化應激損傷的分子靶點對PD治療具有重要意義。miR-34a是一種與細胞凋亡和氧化應激反應關系密切的miRNA。Zhong等[15]研究指出，miR-34a的下調可抑制氧化低密度脂蛋白誘導的人臍靜脈內皮細胞凋亡和氧化應激。季青山等[16]研究發現，下調miR-34a表達可使氧化應激條件下人晶狀體上皮細胞存活率升高，改善過氧化氫誘導氧化損傷。miR-34a是一種在腦組織中廣泛表達的miRNA，被證實與阿爾茨海默病、癲癇和PD病等神經性疾病的發生發展關系密切[17-19]，且miR-34a低表達在神經細胞損傷過程中發揮著重要保護作用[20,21]。SIRT1是一種在調控細胞周期、能量代謝、抗炎、抗氧化應激和抗凋亡等多種細胞功能中發揮著重要作用的去乙酰化酶，被證實其激活可通過抑制MAPK通路保護MPP+誘導的SH-SY5Y細胞凋亡和氧化應激[22]。

本研究通過轉染miR-34a抑制劑成功下調miR-34a的表達后發現，MPP+誘導SH-SY5Y細胞凋亡和氧化應激損傷均明顯受到抑制；同時轉染SIRT1干擾序列成功下調SIRT1 表達后發現，miR-34a低表達對MPP+誘導SH-SY5Y細胞凋亡和氧化應激的抑制作用明顯減弱。這表明miR-34a低表達可通過靶向SIRT1抑制MPP+誘導SH-SY5Y細胞凋亡和氧化應激。該結果與Wang等[23]發現的抑制miR-34a可通過靶向激活SIRT1減輕腸缺血/再灌注誘導的氧化應激和凋亡的分子機制相似。

綜上所述，miR-34a表達抑制在MPP+誘導SH-SY5Y細胞凋亡和氧化應激過程中具有保護作用，而miR-34a對SIRT1的靶向激活是該過程的重要機制。這可能是miR-34a低表達發揮PD神經保護作用的新線索，也為miR-34a有望成為PD防治的候選靶基因提供新的參考依據。