人類血小板抗體在不同年齡性別兒童免疫性血小板減少癥中的表達及其治療中的意義

張劉仟，朱從奎，尤建國，顧小文

免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia，ITP)為兒童常見臨床出血性疾病，在兒童出血性疾病中占1/4，以血小板數量減少、束臂試驗陽性、皮膚黏膜自發性出血、延長出血時間和血塊收縮不良為主要臨床表現。ITP為一種自限性疾病，以維持血小板數量處于安全水平為主要治療目的，主要為避免嚴重出血的發生。有學者報道，血小板計數≤30×109/L為界為初始指征是可行的，首先進行觀察再治療并不會對早期療效減弱，也不會使嚴重臟器出血等情況出現[1]。研究還報道，ITP患者與健康兒童比較其體內血小板抗體水平呈明顯升高趨勢，具有一定ITP臨床診斷價值[2]。目前對于血小板抗體增高程度和其在ITP患者治療的臨床意義尚未發現較多報道，基于此，本研究病歷匯總了人類血小板抗體(human platelet antibody，HPA)與治療短期有效率之間的這個方面，主要對HPA陽性率、不同性別、年齡與ITP短期有效率關系進行了分析探討。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取南京醫科大學附屬淮安第一醫院2019年1-8月確診的60例原發性ITP并行HPA檢測的患者作為研究對象，其中男34例，女26例；年齡1個月～12歲。根據年齡的不同分為<3歲組和≥3歲組(不超過18歲)；根據HPA值的不同分為1∶10組、<1∶10組[HPA(-)組]和>1∶10組[HPA(+)組]，其中，1∶10組30例、<1∶10組22例、>1∶10組8例。納入標準：ITP患者符合2013年兒童ITP疾病診治建議[3]：(1)正常血細胞形態，血小板計數<100×109/L；(2)皮膚出現瘀斑、出血點或臟器出血和黏膜等情況；(3)一般脾臟無增大；(4)骨髓中巨核細胞數正常或增加，有成熟障礙；(5)本研究經醫學倫理委員會批準，所有患者或家屬均自愿簽署知情同意書。排除標準：(1)系統性紅斑狼瘡者；(2)其他自身免疫性疾病者；(3)遺傳性血小板減少癥或以血小板計數減少為首發表現的再生障礙性貧血者；(4)低增生性白血病者。

1.2 儀器和方法 (1)儀器：取德國歐蒙醫學實驗診斷股份公司生產的抗血小板抗體檢測試劑盒和加樣板，采用間接免疫熒光法。試劑盒成分包括陰性對照、陽性對照、生物載片、pH值為7.2的磷酸鹽緩沖液、蓋玻片、封片介質、吐溫20和羊抗人IgG(異硫氰酸熒光素標記)。其中陰性對照為自身抗體陰性(人源)，陽性對照為抗血小板抗體IgG陽性(人源)。(2)方法：包括制備血小板懸液、標記血小板抗體和顯微鏡下觀察熒光強度。首先取患者1.2～2.0 ml乙二胺四乙酸抗凝血，以800 r/min(離心半徑20 cm)離心10 min，之后將富血小板血漿分離，磷酸鹽緩沖液、吐溫緩沖液按1∶10稀釋血漿 。然后加樣板反應區中加入稀釋30 μl血漿，用加樣板凹槽蓋入載片覆有生物膜的一面，于18～25 ℃下溫育(過程中清潔加樣板反應區需滴加25 μl異硫氰酸熒光素標記的抗人球蛋白)，時間為30 min，需避光處理，之后將反應膜片進行沖洗(磷酸鹽緩沖液、吐溫緩沖液)，需5 min浸泡時間，載片水分用吸水紙吸干，然后充分接觸二抗所在反應區，溫育30 min，需避光并5 min浸泡處理，將蓋玻片和封片介質備好，載片水分用吸水紙吸干，蓋玻片嵌入載片。最后顯微鏡下觀察熒光強度，比較陰性和陽性對照結果。

1.3 觀察指標與評價標準 分析HPA和年齡、性別及治療的短期有效率之間的關系。短期有效率[4]按相關標準分完全反應、有效、激素依賴和無效。完全反應為無出血，治療后血小板計數≥100×109/L；有效為無出血，治療后血小板計數≥30×109/L，增加2倍基礎血小板計數；激素依賴為避免出血，皮質激素連續使用使血小板計數≥30×109/L；無效為有出血，治療后血小板計數<30×109/L或無法增加2倍基礎血小板計數。ITP療效判斷需行2次檢測，2次間隔7 d及以上。將療效分為有效組和無效組，激素依賴和無效為無效組，完全反應和有效為有效組。

1.4 統計學處理 采用SPSS 23.0統計軟件包處理。符合正態分布的計數資料采用率或百分比進行描述，采用卡方檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ITP患者一般情況和不同年齡組的男女比 60例原發性ITP并行HPA檢測的患者中男34例(56.67%)，女26例(43.33%)，男女比為1.31∶1.0；年齡1個月～12歲。HPA檢測患者中不同年齡階段的性別比例明顯不同(P<0.05)， <3歲組男性占多數，≥3歲組女性占多數。見表1。

表1 ITP患者一般情況和不同年齡組的男女比

注：ITP為免疫性血小板減少癥。與<3歲組比較χ2=0.003，aP<0.05

2.2 ITP患者不同性別HPA陽性率比較 不同性別HPA陽性率比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 ITP患者不同性別HPA陽性率比較

注：ITP為免疫性血小板減少癥,HPA為人類血小板抗體

2.3 ITP患者不同年齡HPA陽性率比較 <3歲組HPA陽性率高于≥3歲組(P<0.05)。見表3。

表3 ITP患者不同年齡HPA陽性率比較

注：ITP為免疫性血小板減少癥，HPA為人類血小板抗體。與<3歲組比較aP<0.05

2.4 ITP患者不同HPA組短期有效率比較 HPA<1∶10組、1∶10組和>1∶10組ITP患者短期有效率分別為90.00%、90.90%和100.00%。HPA>1∶10組短期有效率高于HPA<1∶10組和1∶10組，差異有統計學意義(P<0.05)。但HPA<1∶10組和1∶10組ITP患者短期有效率比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 ITP患者不同HPA組短期有效率比較

注：ITP為免疫性血小板減少癥,HPA為人類血小板抗體。與HPA>1∶10組比較aP<0.05

3 討論

當機體免疫功能出現紊亂時，可直接破壞血小板導致血小板數量減少，也可以通過抑制骨髓巨核細胞的分化，降低血小板的生成，ITP為部分自限性出血性疾病和自身免疫性疾病。大多數認為血小板生成減少和血小板破壞增加為導致ITP血小板生成減少的主要因素。目前研究發現，免疫反應異常、感染和遺傳易感性為ITP主要發生機制[5]。免疫反應異常表現在自然殺傷細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞等免疫細胞功能異常、細胞因子和血小板抗體產生異常。之前有研究報道過ITP受感染后體內會有交叉反應性抗血小板自身抗體產生，但尚不完全明確其發生機制[6]。感染作為ITP主要發生機制之一，可致機體抗血小板克隆抗體被感染病原體的交叉抗原反應激活，從而破壞血小板，目前也有免疫接種和手足口病等均可使患兒體內減少血小板數量的相關報道。遺傳因素對患兒體內免疫功能異常的研究尚未見相關報道。研究發現，ITP與自身免疫性淋巴細胞增生綜合征和普通多變型免疫缺陷病密切相關[7]。另有研究發現，ITP患者體內血小板抗體在一定程度上可影響血小板功能[8]。

本研究結果顯示，ITP患者<3歲組男童占多數，其發病率也更高，其中<3歲組和≥3歲組男女比例差異具有統計學意義。研究發現，ITP患者男童占多數，<3歲組男童比例更高[9]。這也與學者研究報道符合[10]。盡管如此，但本研究中，不同性別的ITP患兒HPA陽性率比較無明顯差異，說明盡管男性兒童的ITP發生率高，但不影響HPA的陽性率。同時，本研究中對于年齡<3歲組HPA陽性率明顯高于≥3歲組，分析原因，<3歲兒童的自身免疫系統發育不夠完善，受外來因素影響時更加容易出現免疫功能紊亂的情況，因而年齡<3歲的ITP患兒HPA陽性率明顯高于≥3歲兒童[11]。本研究還發現，HPA<1∶10組和1∶10組ITP患者短期有效率比較差異無統計學意義，但HPA>1∶10組短期有效率高于HPA<1∶10組和1∶10組，接近100%。說明HPA陽性率高的患兒給予治療方案治療會產生更好的效果和反應。這與相關研究結論存在不同，可能與抗體組成和抗體檢測方式有關。目前一致認為，免疫異常明顯的患兒其接受治療方式更有效果，對于免疫應答較弱的患兒可從遺傳治療、基因治療等方面進行靶向藥物治療。

目前ITP患者主要治療方式包括免疫球蛋白靜脈注射、糖皮質激素大劑量沖擊療法、脾切除或服用血小板生成素等，加上抗感染治療等對癥治療和基礎治療，這些治療方式對免疫應答較明顯的患兒進行了實際驗證。許多專家認為，遺傳治療和基因治療為前沿靶向治療，可作為研究的重點和熱點。希望將來有更好的治療方式惠及ITP患者。

綜上所述，ITP患者<3歲組男性占多數，其HPA陽性率更高。同時HPA檢測在一定程度上能指導ITP診斷，HPA>1∶10組在臨床上短期有效率更高。