青蒿的離體快繁技術研究

張 鳳，劉 麗，黃錦榮，蔡梅玲

(廣東省梅州市林業科學研究所，廣東 梅州 514011)

1 引言

青蒿(ArtemisiaannuaL.)又被人們稱為黃花蒿,為菊科(Compositae)蒿屬(ArtemisiaLinn)一年生草本植物[1],于花蕾期采收，割取地上部分再將其切碎并曬干，古時候將之稱為“菣”。入藥具有清熱、涼血、退蒸、解暑、祛風、止癢、止盜汗、防中暑等功效，用作陰虛潮熱的退熱劑。經常用于溫邪傷陰，夜熱早涼，陰虛發熱，骨蒸勞熱，暑邪發熱，瘧疾寒熱，濕熱黃疸等病癥的治療。廣泛分布于我國各個地方、亞洲其他地區、北美洲以及歐洲東部也有生長[2,3]。青蒿素是青蒿的主要活性成分，它是一種新型的倍半萜內酯化合物，世界衛生組織將其稱作“世界上唯一有效的瘧疾治療藥物”，具有起效快、效果好、毒性低的抗瘧性能[3～8]。雖然目前已經能夠通過人工合成途徑來獲得青蒿素,但是人工合成成本太高,毒性和難度太大,還沒能投入實際生產。因此，田間栽培的黃花蒿是藥用青蒿素的原料來源。但是天然植物中的青蒿素含量普遍偏低,且不穩定,又因受環境因素的影響,品質難以控制,培育青蒿素含量高且穩定的新品種有著明顯的應用價值。現今，以青蒿的葉片、腋芽等材料作為外植體進行組織培養與繁殖于一些報道上可見，但是由于對青蒿葉片、腋芽和花序的消毒條件難以把握，使得污染率較高，很難進行規范化生產[ 3,9，10]。本實驗以青蒿莖段為外植體，采用MS與不同種類、濃度激素組合的培養基,研究了青蒿莖段的消毒條件、叢生芽的誘導以及根系的生長狀況,旨在通過組織培養技術為青蒿的快速繁殖提供基礎平臺。

2 材料和方法

2.1 材料

露地栽培青蒿的帶芽嫩莖，該材料是經測定的青蒿素含量較高的植株。

2.2 方法

2.2.1 培養基以及培養條件

用MS培養基作為基礎培養基,附加蔗糖30 g/L ,瓊脂7 g/L，附以不同比例的激素，pH值為5.5～6.0,121 ℃高溫滅菌20 min 。培養條件為26±2 ℃，光照1500～2000 lux，每天光照12 h。

2.2.2 外植體的消毒

選取生長良好的青蒿嫩莖，剪去葉片，用流水沖洗掉表面的灰塵，在無菌工作臺中先用70%乙醇浸泡30 s，再用0.1%的升汞分別消毒8 min、9 min以及10 min，然后用無菌水清洗6～8次。最后將無菌外植體切成1 cm左右的帶節莖段，將切好的無菌莖段接種到培養基中。每瓶接種一個外植體，每個處理接種20瓶，大約15天以后，對污染率進行統計，找出最適宜的消毒時間。

2.2.3 不定芽的誘導

重新選取生長良好的青蒿莖段加以消毒，消毒過程中 0.1%的升汞消毒時間采用消毒效果最佳的消毒時間，消毒完成后，將無菌外植體放入配置好的不定芽誘導培養基中，每瓶接種一個外植體，每個處理接種20瓶。共設計了3種添加了IBA、6BA 的MS培養基，每20 d左右更換一次培養基。對叢生芽的生長情況進行統計，確定誘導效果最佳的培養基。

2.2.4 生根培養以及煉苗

共設計了3種添加了IBA、NAA的1/4 MS培養基,待苗長至2～3 cm 時,分成單株，除去基部的愈傷組織,接種于生根培養基中,7 d左右開始生根,15 d后開始煉苗，打開瓶蓋 ,在瓶子里加入適量蒸餾水，置于室溫下2～3 d。取出小苗,洗去根部的培養基，移栽到事先準備好的土壤中,澆透水,用塑料膜蓋3 d ,然后定期澆水及觀察，統計成活率可達90%以上。

3 結果與分析

3.1 外植體的消毒和不定芽的誘導

選取生長良好的青蒿嫩莖，剪去葉片，用流水沖洗掉表面的灰塵，在無菌工作臺中先用70%乙醇溶液浸泡30 s,再用0.1%的升汞消毒8 min、9 min以及10 min。然后將無菌外植體切成1 cm左右的帶節莖段，將其接種到叢生芽誘導培養基中，大約15 d以后，對污染率進行統計，結果見表1。

表1 0.1%的升汞不同消毒時間的消毒效果

注：標有不同英文字母者為差異達到0.05顯著水平，下同

從表1中可以知道：不同消毒時間下污染率的差異十分明顯。隨著消毒時間的增加，污染率也逐漸降低，但是在消毒時間為10 min時，出現了極為嚴重的褐化現象，不利于青蒿叢生芽的進一步生長。因此，將0.1%的升汞的消毒時間控制在9 min左右較為適宜。

利用MS與不同濃度6-BA 與IBA激素組合的培養基,對青蒿莖段進行不定芽誘導,15 d以后，對不定芽的生長結果進行統計，以確定不定芽誘導效果最佳的培養基 (見表 2)。

表2 青蒿不定芽誘導實驗

從表2中可以看出，在IBA的濃度為0.1 mg/L、6-BA的濃度為1 mg/L、1.5 mg/L、2 mg/L時，青蒿莖段的不定芽誘導率都非常高，均達到了100%。且以上3種培養基中皆沒有發現畸形苗和變異苗,由此可知青蒿不定芽繁殖遺傳穩定性較好。1號培養基中芽苗呈深綠色并且生長狀況良好，2號和3號培養基中，在莖段基部容易形成白色、疏松的愈傷組織，芽苗長勢較差，并且產生的不定芽數量與1號培養基相比明顯有所下降，說明高濃度的細胞分裂素并不利于叢生芽的生長。故1號培養基(MS+6-BA 1 mg/L+IBA0.1 mg/L)為叢生芽的最佳誘導培養基。

3.2 試驗苗的生根

等到不定芽生長至2～3 cm 時,于MS+6-BA 1 mg/L+IBA0.1 mg/L培養基中選取生長幾乎一致的芽苗切分成若干單株,除去基部的愈傷組織后轉接到生根培養基上，過一段時間以后，對生根情況進行觀察和統計。

表3 青蒿的生根試驗

統計結果表明:1號培養基中生根率較低，僅在50%左右，2號和3號培養基中生根率較高，均達到了90%以上。隨著IBA濃度的增加，主根數量并沒有明顯的增加，但是側根明顯更加發達，因此適當的增加IBA的濃度更加有助于實驗苗的生根。然而研究發現，當IBA濃度達到2.0 mg/L時，根系較細，而2號培養基(1/4MS+NAA 0.1 mg/L+IBA 1.5 mg/L)的生根情況最好,生根數量多且根系粗壯,并且芽苗種植以后，存活率高達90%以上，更適用于遺傳學的研究,故此培養基為最佳生根培養基。

4 討論

近些年來，藥用植物越來越受到人們的親睞，但隨著人們對藥用植物需求的增加，野生的藥用植物，尤其是一些珍稀的藥用植物，由于一直以來受到人類毫無節制地采摘,其資源早已不可能滿足市場的需求。因此，植物組織培養技術已經成為保存這些珍稀藥用植物資源不可或缺的技術手段，許多珍稀的藥用植物已經利用組織培養技術實現了資源的保存，同時使市場的需求得到了解決[11～14]。

本研究以青蒿幼嫩的帶芽莖段作為外植體，使用常規的培養基、消毒劑和植物激素，展開了消毒、叢生芽誘導、生根等一系列研究。但是本實驗采用的培養基組合與其它研究的略有不同，同時本研究以莖段為外植體直接進行不定芽誘導，取材方便，容易消毒，省去了脫分化形成愈傷組織這一過程，節約了較多時間。但在研究中發現青蒿莖段中含有許多的酚類化合物，切芽時產生的創傷會將組織中的多酚氧化酶激活。該酶很容易被氧化為棕褐色的醌類物質，使外植體的切口處發生褐變，并滲透到培養基中，致使培養基褐化,同時給培養物的生長和分化帶來嚴重的影響，甚至會造成培養物的死亡[15，16]。及時的轉接能夠有效防止褐變,有利于試驗苗的健康生長。

本研究還發現6BA和IBA結合的MS培養基非常利于叢生芽的誘導，在本研究中選用的激素濃度下，青蒿莖段叢生芽的誘導率全部達到了100%,但是通過比較不定芽的數量和生長狀況，MS+6-BA 1mg/L+IBA0.1mg/L是誘導產生叢生芽的最佳培養基。IBA和NAA結合的1/4MS培養基非常利于根的生成，生根率均達到了90%以上，但生根數量多且根系粗壯的NAA 0.1 mg/L+IBA 1.5 mg/L培養基是誘導生根的最佳培養基，栽種后存活率也達到了90%以上。本研究為工廠化培育優良無性系種苗提供了理論基礎和一定的材料。