青蒿的離體快繁技術研究

張 鳳，劉 麗，黃錦榮，蔡梅玲

(廣東省梅州市林業(yè)科學研究所，廣東 梅州 514011)

1 引言

青蒿(ArtemisiaannuaL.)又被人們稱為黃花蒿,為菊科(Compositae)蒿屬(ArtemisiaLinn)一年生草本植物[1],于花蕾期采收，割取地上部分再將其切碎并曬干，古時候將之稱為“菣”。入藥具有清熱、涼血、退蒸、解暑、祛風、止癢、止盜汗、防中暑等功效，用作陰虛潮熱的退熱劑。經常用于溫邪傷陰，夜熱早涼，陰虛發(fā)熱，骨蒸勞熱，暑邪發(fā)熱，瘧疾寒熱，濕熱黃疸等病癥的治療。廣泛分布于我國各個地方、亞洲其他地區(qū)、北美洲以及歐洲東部也有生長[2,3]。青蒿素是青蒿的主要活性成分，它是一種新型的倍半萜內酯化合物，世界衛(wèi)生組織將其稱作“世界上唯一有效的瘧疾治療藥物”，具有起效快、效果好、毒性低的抗瘧性能[3～8]。雖然目前已經能夠通過人工合成途徑來獲得青蒿素,但是人工合成成本太高,毒性和難度太大,還沒能投入實際生產。因此，田間栽培的黃花蒿是藥用青蒿素的原料來源。但是天然植物中的青蒿素含量普遍偏低,且不穩(wěn)定,又因受環(huán)境因素的影響,品質難以控制,培育青蒿素含量高且穩(wěn)定的新品種有著明顯的應用價值?，F今，以青蒿的葉片、腋芽等材料作為外植體進行組織培養(yǎng)與繁殖于一些報道上可見，但是由于對青蒿葉片、腋芽和花序的消毒條件難以把握，使得污染率較高，很難進行規(guī)范化生產[ 3,9，10]。本實驗以青蒿莖段為外植體，采用MS與不同種類、濃度激素組合的培養(yǎng)基,研究了青蒿莖段的消毒條件、叢生芽的誘導以及根系的生長狀況,旨在通過組織培養(yǎng)技術為青蒿的快速繁殖提供基礎平臺。

2 材料和方法

2.1 材料

露地栽培青蒿的帶芽嫩莖，該材料是經測定的青蒿素含量較高的植株。

2.2 方法

2.2.1 培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件

用MS培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基,附加蔗糖30 g/L ,瓊脂7 g/L，附以不同比例的激素，pH值為5.5～6.0,121 ℃高溫滅菌20 min 。培養(yǎng)條件為26±2 ℃，光照1500～2000 lux，每天光照12 h。

2.2.2 外植體的消毒

選取生長良好的青蒿嫩莖，剪去葉片，用流水沖洗掉表面的灰塵，在無菌工作臺中先用70%乙醇浸泡30 s，再用0.1%的升汞分別消毒8 min、9 min以及10 min，然后用無菌水清洗6～8次。最后將無菌外植體切成1 cm左右的帶節(jié)莖段，將切好的無菌莖段接種到培養(yǎng)基中。每瓶接種一個外植體，每個處理接種20瓶，大約15天以后，對污染率進行統(tǒng)計，找出最適宜的消毒時間。

2.2.3 不定芽的誘導

重新選取生長良好的青蒿莖段加以消毒，消毒過程中 0.1%的升汞消毒時間采用消毒效果最佳的消毒時間，消毒完成后，將無菌外植體放入配置好的不定芽誘導培養(yǎng)基中，每瓶接種一個外植體，每個處理接種20瓶。共設計了3種添加了IBA、6BA 的MS培養(yǎng)基，每20 d左右更換一次培養(yǎng)基。對叢生芽的生長情況進行統(tǒng)計，確定誘導效果最佳的培養(yǎng)基。

2.2.4 生根培養(yǎng)以及煉苗

共設計了3種添加了IBA、NAA的1/4 MS培養(yǎng)基,待苗長至2～3 cm 時,分成單株，除去基部的愈傷組織,接種于生根培養(yǎng)基中,7 d左右開始生根,15 d后開始煉苗，打開瓶蓋 ,在瓶子里加入適量蒸餾水，置于室溫下2～3 d。取出小苗,洗去根部的培養(yǎng)基，移栽到事先準備好的土壤中,澆透水,用塑料膜蓋3 d ,然后定期澆水及觀察，統(tǒng)計成活率可達90%以上。

3 結果與分析

3.1 外植體的消毒和不定芽的誘導

選取生長良好的青蒿嫩莖，剪去葉片，用流水沖洗掉表面的灰塵，在無菌工作臺中先用70%乙醇溶液浸泡30 s,再用0.1%的升汞消毒8 min、9 min以及10 min。然后將無菌外植體切成1 cm左右的帶節(jié)莖段，將其接種到叢生芽誘導培養(yǎng)基中，大約15 d以后，對污染率進行統(tǒng)計，結果見表1。

表1 0.1%的升汞不同消毒時間的消毒效果

注：標有不同英文字母者為差異達到0.05顯著水平，下同

從表1中可以知道：不同消毒時間下污染率的差異十分明顯。隨著消毒時間的增加，污染率也逐漸降低，但是在消毒時間為10 min時，出現了極為嚴重的褐化現象，不利于青蒿叢生芽的進一步生長。因此，將0.1%的升汞的消毒時間控制在9 min左右較為適宜。

利用MS與不同濃度6-BA 與IBA激素組合的培養(yǎng)基,對青蒿莖段進行不定芽誘導,15 d以后，對不定芽的生長結果進行統(tǒng)計，以確定不定芽誘導效果最佳的培養(yǎng)基 (見表 2)。

表2 青蒿不定芽誘導實驗

從表2中可以看出，在IBA的濃度為0.1 mg/L、6-BA的濃度為1 mg/L、1.5 mg/L、2 mg/L時，青蒿莖段的不定芽誘導率都非常高，均達到了100%。且以上3種培養(yǎng)基中皆沒有發(fā)現畸形苗和變異苗,由此可知青蒿不定芽繁殖遺傳穩(wěn)定性較好。1號培養(yǎng)基中芽苗呈深綠色并且生長狀況良好，2號和3號培養(yǎng)基中，在莖段基部容易形成白色、疏松的愈傷組織，芽苗長勢較差，并且產生的不定芽數量與1號培養(yǎng)基相比明顯有所下降，說明高濃度的細胞分裂素并不利于叢生芽的生長。故1號培養(yǎng)基(MS+6-BA 1 mg/L+IBA0.1 mg/L)為叢生芽的最佳誘導培養(yǎng)基。

3.2 試驗苗的生根

等到不定芽生長至2～3 cm 時,于MS+6-BA 1 mg/L+IBA0.1 mg/L培養(yǎng)基中選取生長幾乎一致的芽苗切分成若干單株,除去基部的愈傷組織后轉接到生根培養(yǎng)基上，過一段時間以后，對生根情況進行觀察和統(tǒng)計。

表3 青蒿的生根試驗

統(tǒng)計結果表明:1號培養(yǎng)基中生根率較低，僅在50%左右，2號和3號培養(yǎng)基中生根率較高，均達到了90%以上。隨著IBA濃度的增加，主根數量并沒有明顯的增加，但是側根明顯更加發(fā)達，因此適當的增加IBA的濃度更加有助于實驗苗的生根。然而研究發(fā)現，當IBA濃度達到2.0 mg/L時，根系較細，而2號培養(yǎng)基(1/4MS+NAA 0.1 mg/L+IBA 1.5 mg/L)的生根情況最好,生根數量多且根系粗壯,并且芽苗種植以后，存活率高達90%以上，更適用于遺傳學的研究,故此培養(yǎng)基為最佳生根培養(yǎng)基。

4 討論

近些年來，藥用植物越來越受到人們的親睞，但隨著人們對藥用植物需求的增加，野生的藥用植物，尤其是一些珍稀的藥用植物，由于一直以來受到人類毫無節(jié)制地采摘,其資源早已不可能滿足市場的需求。因此，植物組織培養(yǎng)技術已經成為保存這些珍稀藥用植物資源不可或缺的技術手段，許多珍稀的藥用植物已經利用組織培養(yǎng)技術實現了資源的保存，同時使市場的需求得到了解決[11～14]。

本研究以青蒿幼嫩的帶芽莖段作為外植體，使用常規(guī)的培養(yǎng)基、消毒劑和植物激素，展開了消毒、叢生芽誘導、生根等一系列研究。但是本實驗采用的培養(yǎng)基組合與其它研究的略有不同，同時本研究以莖段為外植體直接進行不定芽誘導，取材方便，容易消毒，省去了脫分化形成愈傷組織這一過程，節(jié)約了較多時間。但在研究中發(fā)現青蒿莖段中含有許多的酚類化合物，切芽時產生的創(chuàng)傷會將組織中的多酚氧化酶激活。該酶很容易被氧化為棕褐色的醌類物質，使外植體的切口處發(fā)生褐變，并滲透到培養(yǎng)基中，致使培養(yǎng)基褐化,同時給培養(yǎng)物的生長和分化帶來嚴重的影響，甚至會造成培養(yǎng)物的死亡[15，16]。及時的轉接能夠有效防止褐變,有利于試驗苗的健康生長。

本研究還發(fā)現6BA和IBA結合的MS培養(yǎng)基非常利于叢生芽的誘導，在本研究中選用的激素濃度下，青蒿莖段叢生芽的誘導率全部達到了100%,但是通過比較不定芽的數量和生長狀況，MS+6-BA 1mg/L+IBA0.1mg/L是誘導產生叢生芽的最佳培養(yǎng)基。IBA和NAA結合的1/4MS培養(yǎng)基非常利于根的生成，生根率均達到了90%以上，但生根數量多且根系粗壯的NAA 0.1 mg/L+IBA 1.5 mg/L培養(yǎng)基是誘導生根的最佳培養(yǎng)基，栽種后存活率也達到了90%以上。本研究為工廠化培育優(yōu)良無性系種苗提供了理論基礎和一定的材料。