加味柴胡疏肝湯調控miR-204影響癲癇小鼠海馬神經元調亡與ATG7、LC3Ⅱ的表達＊

汪順貴，玉 倩，李華霞，李 歡，盧 玲，廖現秋，周艷英，宋 曦，秦紅玲，刁麗梅＊＊

（1. 廣西中醫藥大學研究生學院 南寧 530023；2. 廣西中醫藥大學第一附屬醫院 南寧 530001）

癲癇（Epilepsy，Ep）是以大腦神經元異常放電為特征的慢性反復發作性短暫性腦功能失調綜合征[1]。目前，全球約有6800 萬人受癲癇困擾[2]，每年每10 萬人中有67.77 人新增確診[3]。癲癇的發病機制仍不明確，臨床藥物治療效果欠佳，因此尋求有效的治療手段已刻不容緩。有研究表明，微小RNA（MicroRNAs；miRNA）與癲癇的發生密切相關[4]，其可以通過調節海馬神經元自噬和凋亡，影響癲癇的發病[5-6]。因此，在治療EP 過程中，調節細胞自噬和凋亡或許可成為更為有效的新的治療方法。臨床及實驗探究發現，中西醫聯合治療癲癇，可以調高藥物的療效，改善EP 患者的預后及藥物的副反應[7]。加味柴胡疏肝湯（Jiawei Chaihu Shugan Tang，JWCHSGT）具有疏肝解郁、化痰熄風的功效，結合前人研究，本課題組前期研究觀察發現，JWCHSGT 可以降低癲癇發作頻率[8-10]，，預測出其靶基因自噬相關基因7（autophagy related gene 7，ATG7）。本實驗通過研究JWCHSGT 干預Ep 小鼠后，觀察其自噬相關基因ATG7、LC3Ⅱ、miR-204 的變化及神經元凋亡情況。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

雄性昆明小鼠70只，其中10只備用，SPF級，6～8周齡，體重25～30 g，由廣西中醫藥大學實驗動物中心提供（許可證：SYXK桂2009-0001）。

1.1.2 主要藥物與試劑

加味柴胡疏肝湯：柴胡15 g、白芍15 g、枳殼（麩炒）10 g、炙甘草6 g、川芎10 g、香附10 g、陳皮（醋炒）9 g、浙貝母15 g、生牡蠣30 g、鉤藤10 g、蜈蚣3條。所有藥材經廣西中醫藥大學羅耽副教授鑒定為正品，符合2015 年版《中華人民共和國藥典》規范，由廣西中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科統一采購備用（每單味藥要求同一產地、同一質量層次、同一批次），采用自動煎藥機煎煮，濃縮至藥物濃度500 mg/mL；鹽酸匹羅卡品（美國Sigma 公司）、硫酸阿托品注射液（鄭州鈴銳制藥有限公司）、0.9%氯化鈉注射液（北京雙鶴藥業有限公司）、卡馬西平片（杭州賽諾菲制藥有限公司）制作成混懸液、蘇木素染色液、返藍液、分化液、DAB 顯色液、mmu-mir-204 antagomir、mmu-mir-204 agomir、Trizol、miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit、miRcute miRNA Detection Kit、miRcute miRNA isolation kit、TIANScript RT KIT、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）、TUNEL試劑盒等。

1.1.3 主要實驗儀器

熒光定量PCR 儀 ABI7500 、生物分光光度計BioPhotometer 、渦旋振蕩儀QL-902、光學顯微鏡BX43、離心機Centrifuge 5415D、攤烤片機KD-T、桌面數顯腦立體定位儀、超薄切片機：EM UC7等。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立與分組

本實驗的所有小鼠自由飲水，適應性飼養1周后，按隨機數字表的法將小鼠隨機分為6 組：A:生理鹽水組、B:模型組、C:加味柴胡疏肝湯組、D:加味柴胡疏肝湯＋miRNA-204 mimic 組、E：加味柴胡疏肝湯＋miRNA-204 inhibitor 組、F:卡馬西平組，每組各 10 只。除對照組外，其余組致癇步驟：先腹腔注射硫酸阿托品17 mg·kg-1，30 min 后腹腔注射鹽酸匹羅卡品180 mg·kg-1，給藥完畢后，按照經典的 Racine（1972）的實驗動物癇性發作標準對動物行為學觀察[11]。注射30 min后，對未出現4級以上發作的動物每隔15 min給予首劑1/3劑量的匹羅卡品追加注射，追加注射2次以后未出現4級以上發作的小鼠，視為造模失敗，不納入下一步行為學觀察。持續癇性發作達到1 h 后給予地西泮腹腔注射，以終止癇性發作。實驗小鼠給藥用量及方法參照《現代醫學實驗動物學》中的標準方程進行計算。灌胃液濃度及等效劑量均參照賀式計量-體表面D2=DIXr2/RI進行合理折算。作如下處理：生理鹽水組即對照組：生理鹽水20 mL·kg-1·d-1灌胃，灌胃2周；模型組：不予加味柴胡疏肝湯灌胃；加味柴胡疏肝湯組：給予加味柴胡疏肝湯 7 g·kg-1·d-1灌胃 2 周；加味柴胡疏肝湯＋miRNA-204 mimic 組：灌胃中藥湯2 周后，在麻醉下通過腦立體定位儀，顱內海馬區注射miRNA-204 mimic 2 μL；加味柴胡疏肝湯＋miRNA-204 inhibitor 組：灌胃中藥湯2 周后，在麻醉下通過腦立體定位儀，顱內海馬區注射miRNA-204 inhibitor 2 μL；卡馬西平組：給予卡馬西平混懸液30 mg·kg-1·d-12 周。兩周后再次使用鹽酸匹羅卡品180 mg·kg-1致癇，對照組采用生理鹽水代替匹羅卡品。最后取材。將小鼠用3.5%水合氯醛按照1 ml/100g 體重的劑量通過腹腔注射麻醉，進行脫頸椎致死后，剪去頭部毛發和頭皮，剝開顱骨，鈍性分離大腦皮層暴露海馬組織，將海馬周圍的大腦組織分開，最后取下海馬保存于液氮中。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Real-time PCR）檢測藥物干預后小鼠海馬miR-204 以及自噬基因ATG7、LC3Ⅱ的表達

取30 mg 海馬組織進行液氮研磨后采用Trizol 法提取總RNA，使用超微量紫外分光光度計檢測其濃度和純度，RNA 純度 A260/A280保持在1.8 ～ 2.2，濃度保持在500～1 000 mg·L-1才可以進行下一步實驗，提取的RNA置于-80℃冰箱中保存。采用Takara 反轉錄試劑盒進行反轉錄實驗，反轉錄反應體系：①37 ℃60 min;②85 ℃ 5 s。PCR 擴增反應在 96 孔板中進行,每個反應做3個復孔，反應體系為 20 μL：cDNA 2 μL,上下 游 引 物 各 0.8 μL, SYRB Green Mix 10 μL, ROX Reference Dye II 0.4 μL, 去離子水 6 μL。PCR 擴增條件：①95 ℃,30 s;②95 ℃,5 s,③60 ℃,34 s,40個循環。采用 Quantity One 軟件進行數據分析，結果采用2-△△CT法進行統計分析。

1.2.3 原位缺口末端標記法（TUNEL）檢測藥物干預后小鼠海馬神經元凋亡情況

切片機將小鼠海馬切片5 μm，烤片65 ℃4.5 h;用二甲苯脫蠟浸洗切片2 次，每次5 min；用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗 1 次，每次 3 min；用Proteinase K 工作液處理組織 20 min 在 37°C；PBS 漂洗3 次，每次 5 min；制備 TUNEL 反應混合液，處理組用50 μL TdT+450 μL 熒光素標記的 dUTP 液混勻；而陰性對照組僅加50 μL 熒光素標記的dUTP 液。于組織上加50 μL TUNEL 反應混合液（陰性對照組僅加50μL熒光素標記的dUTP液）于標本上，在避光濕盒中反應37 ℃× 1 h。PBS 漂洗3 次，每次5 min；玻片干后加50 μL converter-POD 于標本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37 ℃×30 min。PBS 漂洗 3 次；在組織處加 50～100 μl DAB 底物，反應 15～25 ℃×10 min；PBS漂洗3次；拍照后再用蘇木素復染，幾秒后立即用自來水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。每張切片選取5 個高倍鏡（10×20）視野（共計200～500個細胞），觀察小鼠海馬C1區凋亡細胞并拍照，計算每100 個細胞內的陽性細胞數。計算TUNEL 性細胞百分率：

陽性細胞百分率＝陽性細胞數/細胞總數×100%。

1.2.4 統計學分析

表1 PCR引物序列

本研究采用SPSS 22.0軟件統計分析，所有數值用均數±標準差（）表示。符合正態分布時，組內前后差異比較采用配對樣本t 檢驗，組間差異比較采用獨立樣本t 檢驗；不符合正態分布采用非參數檢驗，用中位數和四分位數間距（Md，（P25，P75））表示。P＞0.05 差異無統計學意義，P＜0.05 為差異有統計學意義，P＜0.01 為差異有極顯著統計學意義。

2 結果

2.1 加味柴胡疏肝湯對癲癇小鼠海馬miR-204 及自噬基因LC3Ⅱ、ATG7表達的影響

與正常組相比，模型組miR-204 表達下調，LC3Ⅱ、ATG7 的表達上調（P＜0.01）；與模型組相比，使用加味柴胡疏肝湯和加味柴胡疏肝湯+miR-204 抑制物后，miR-204 表達上調，LC3Ⅱ、ATG7 的表達下調（P＜0.05）；卡馬西平組和加味柴胡疏肝湯+miR-204 模擬物組，miR-204 表達上調、LC3Ⅱ、ATG7 的表達下調更加顯著（P＜0.01）。詳見表2。

2.2 加味柴胡疏肝湯對癲癇小鼠海馬神經元凋亡的影響

TUNEL 陽性細胞為凋亡的海馬神經元，光鏡下其陽性細胞表現為細胞核內有棕黃色或棕褐色顆粒；正常非凋亡細胞，胞核被蘇木素染成藍色，其大小，形態相對一致。圖片生理鹽水組（A 組）海馬C1 區可見個別陽性細胞，模型組（B 組）海馬C1 區可見大量陽性細胞，加味柴胡疏肝湯組（C 組）其陽性細胞較模型組明顯減少，加味柴胡疏肝湯＋miRNA-204 mimic 組（D組）陽性細胞較單純使用柴胡疏肝湯減少，加味柴胡疏肝湯＋miRNA-204 inhibitor 組（E 組）陽性細胞介于C組和D組之間，卡馬西平組（F組）陽性細胞較生理鹽水組稍有增多，采用單因素方差統計分別對各組TUNEL 陽性細胞數進行比較，結果顯示：不同組別的陽性細胞凋亡指數存在明顯差異（F=520.65，P＜0.01），進一步進行組間比較發現任意兩組神經元凋亡指數均存在明顯差異（P＜0.01）。詳見圖1、表3。

表2 相關基因在不同組小鼠海馬中表達量(，n=10)

表2 相關基因在不同組小鼠海馬中表達量(，n=10)

注：與生理鹽水組相比，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01，有統計學意義；與模型組相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，有統計學意義

miR204 1.01±0.07 0.17±0.03ΔΔ 0.31±0.03▲0.58±0.09▲▲0.29±0.03▲0.66±0.08▲▲組別生理鹽水組模型組疏肝湯組疏肝湯+miR204模擬物組疏肝湯+miR204抑制劑組卡馬西平組ATG7 0.96±0.07 8.78±0.27ΔΔ 3.84±0.85▲2.56±0.85▲5.96±0.63▲1.93±0.32▲▲LC3II 1.03±0.05 6.76±0.46ΔΔ 3.67±0.74▲1.88±0.41▲▲4.82±0.36▲1.59±0.09▲▲

3 討論

癲癇是人類第二大神經系統疾病，嚴重影響人類的健康，西藥具副作用大，易復發，療效不穩點等確定，中醫利用辨證論治的方法運用不同的方藥，對于癲癇患者的調養、服藥后副作用及遠期預后要優于西醫。癲癇，中醫稱之為“癇病”，《三因極一病證方論·癲癇敘論》認為癇病的病機與肝的疏泄功能異常關系密切，其風、痰、瘀產生均為肝氣失于疏泄、條達的病理變化，因而“從肝論治”是治療癇病的關鍵所在[9]。柴胡疏肝湯具有鎮肝、疏肝、解郁的功效，已有臨床研究發現，其用于治療癲癇具有滿意的療效[12-13]。實驗研究研究表明柴胡皂苷，具有抗驚厥和鎮靜作用，能夠減少癲癇患者和動物模型的抽搐、異常腦電、凝視等癥狀的發生[14-15]。而浙貝母可以下調難治性癲癇大鼠模型的耐藥蛋白表達，降低癲癇發作頻率[16]。有研究表明，自噬和凋亡作用的過程與中醫的陰陽和平衡理論相通，過度或者不足的自噬及凋亡均可以導致疾病的發生[17-18]。

圖1 加味柴胡疏肝湯對癲癇小鼠海馬C1區神經元細胞凋亡的影響（TUNEL,×200）

表3 加味柴胡疏肝湯對癲癇小鼠海馬C1區神經元細胞凋亡指數的影響（，n=10）

表3 加味柴胡疏肝湯對癲癇小鼠海馬C1區神經元細胞凋亡指數的影響（，n=10）

注：各組兩兩比較P＜0.01，有統計學意義。凋亡指數=凋亡細胞數/細胞總數

F值P值520.65＜0.01組別生理鹽水組模型組疏肝湯組疏肝湯+miR204模擬物組疏肝湯+miR204抑制劑組卡馬西平組細胞凋亡指數/%4.75±0.96 63.75±1.71 40.50±1.29 25.75±3.40 49.25±2.50 8.50±1.29

癲癇的發病機制尤為復雜，近年來發現癲癇所導致的海馬神經元損傷與細胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）有密切關系[19-20]。PCD 包括凋亡、自噬、程序性壞死、焦亡、鐵死亡等，其中細胞凋亡稱之為I 型細胞程序性死亡，細胞自噬稱之為II 型細胞程序性死亡[21]，這兩種是主要的細胞程序性死亡。正常生理性凋亡和自噬對于機體是有利的，而過度的細胞程序性死亡可以導致海馬神經元丟失、膠質細胞增生、突觸結構或傳遞異常、炎性反應、血管再生、離子通道的改變等，促使大腦異常放電，誘發癲癇[22-23]。越來越多的研究發現miRNA 在轉錄后水平調控基因的表達，影響相關自噬、凋亡信號通路，如mTOR、Wnt/βcatenin 等通路參與癲癇的發生[24-25]。研究發現，心肌細胞在缺血缺氧條件下，可以使miRNA-204 表達降低，從而增加LC3-Ⅱ的表達水平，使心肌細胞過度自噬，加重心肌的壞死[26]。miR-204 還可以通過保護海馬神經元，抑制癲癇樣放電[27]。

本實驗發現，癲癇小鼠海馬神經元凋亡較正常小鼠明顯增加，miRNA-204 下降，且相關自噬基因ATG7、LC3Ⅱ增多；而使用加味柴胡疏肝湯干預過后海馬神經元凋亡明顯減少，miRNA-204 回升，自噬基因ATG7、LC3Ⅱ降低。同時，本課題組進行了miRNA-204 的抑制及過表達后發現，加味柴胡疏肝湯使miRNA-204 高，升高的 miRNA-204 可以抑制 ATG7、LC3Ⅱ的過度表達，減少神經元凋亡率。綜上所述，加味柴胡疏肝湯可能減少神經元的自噬與凋亡，治療癲癇。