食源性肥胖大鼠模型制備中相關(guān)影響因素分析探討＊

姚俊鵬 ，周思遠(yuǎn) ，陳麗萍 ，張 林 ，2，李 瑛 ＊＊

（1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院 成都 610075；2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，四川省糖尿病防治中心成都 610041）

有研究發(fā)現(xiàn)，中國的肥胖人數(shù)位居世界第一[1]。肥胖不僅增加許多致死性慢性疾病的患病率（如癌癥和心腦血管疾病），且破壞形體美觀，阻礙正常的自我認(rèn)知與人際交往，給患者的心理健康和生活質(zhì)量造成很大的影響[2，3]。大量臨床實(shí)踐及實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，針刺干預(yù)肥胖病療效確切，但其機(jī)制研究仍有許多困惑存在，建立合適的動物模型是進(jìn)一步深入研究針刺療效機(jī)制的重要方法學(xué)工具。用于研究肥胖的動物模型中，以食源性肥胖（Diet-induced Obesity，DIO）動物模型與人類肥胖病最具有相似之處[4]，而大鼠因生長發(fā)育過程中所體現(xiàn)的大量生物學(xué)特性與人類高度相似，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，便于組織取材和常規(guī)指標(biāo)監(jiān)測等，常作為構(gòu)建DIO 模型的實(shí)驗(yàn)動物[5]。

通過回顧眾多的肥胖模型研究文獻(xiàn)，本研究發(fā)現(xiàn)國內(nèi)外研究者在構(gòu)建DIO 大鼠模型時，大鼠的選擇、飼料配方、喂養(yǎng)方法及造模持續(xù)時間等因素各不相同，有時會造成結(jié)果差異較大，影響實(shí)驗(yàn)的可信度，并妨礙不同研究結(jié)果間的比較和分析。除此之外，文獻(xiàn)中DIO大鼠肥胖的建模率大多在45%-65%之間：一方面，歸咎于肥胖抵抗（obesity-resistance，OR）因素[6，7]的存在；另一方面，則與大鼠選擇、飼料配方等多種因素影響有關(guān)。前期研究[8]發(fā)現(xiàn)，針刺可調(diào)控下丘腦自噬水平減輕DIO 大鼠體質(zhì)量，同時建立穩(wěn)定可靠的DIO大鼠模型對進(jìn)一步深入探討針刺減重的分子機(jī)制十分重要。因此，本研究從大鼠選擇、飼料配方及喂養(yǎng)方法等方面分析討論，影響飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠模型結(jié)果穩(wěn)定性及可重復(fù)性的主要因素，并提出相關(guān)造模方案，以期為針刺干預(yù)肥胖病的實(shí)驗(yàn)研究提供參考和借鑒。

1 DIO大鼠模型建立的影響因素

1.1 大鼠的選擇

本研究的實(shí)驗(yàn)大鼠由于品系、性別及年齡的差異，各有對應(yīng)的生理特征及優(yōu)缺點(diǎn)。根據(jù)研究目的選擇最合適的實(shí)驗(yàn)對象，建立一種最接近人類肥胖的理想動物模型對于研究肥胖病理機(jī)制和防治措施有著重要的意義。

1.1.1 品系因素

由于遺傳背景的差異，大鼠品系不同是造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致的因素之一。1970 年，密執(zhí)安大學(xué)Schemmel 等[9]研 究 提 出 ，Osborne-Mendel（OM）、Sprague-Dawley（SD）及 Wistar 大鼠致肥胖效果好，而Wistar-Lewis 效果差。大鼠的品系差異在對高脂飼料的敏感性方面有所體現(xiàn)，如用高脂飼料（High Fat Diet，HFD）投食S5B/P1 大鼠時其食欲降低，攝食量減少，體質(zhì)量增加不顯著，而OM 大鼠則偏愛高脂成分、攝食量大，僅用2周即造模成功[10]。Douglas等[11]對OM和S5B/P1 大鼠進(jìn)行13%和56%脂肪供能飼料的自由選擇實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)OM 大鼠消耗更多的高脂供能飼料，而S5B/P1大鼠更喜食低脂飼料。根據(jù)Osborne-Mendel 大鼠和S5B/P1 大鼠對高脂飼料敏感性的差異，國外學(xué)者多運(yùn)用其進(jìn)行個體肥胖易感（obesity-prone,OP）和OR的機(jī)制研究[12，13]。品系的差異還體現(xiàn)在脂肪堆積效應(yīng)上，如 Jonatan 等[14]同時利用 SD 和 Wistar 兩種品系的大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在同樣的條件下，Wistar大鼠不僅肥胖行為學(xué)特征出現(xiàn)較早，且體內(nèi)脂肪堆積較SD 大鼠更為明顯，尤其是在附睪脂肪墊。有研究[15]認(rèn)為，這一現(xiàn)象的發(fā)生與SD 大鼠腸道菌群中類桿菌和普氏桿菌的含量較Wistar 大鼠低，但雙歧桿菌和乳酸桿菌的含量較高有關(guān)。

1.1.2 性別因素

Kang 等[16]發(fā)現(xiàn)，在臨床上，女性肥胖患者并發(fā)糖尿病及心血管疾病的風(fēng)險較男性更高。在DIO 模型中，性別的差異影響著大鼠對不同營養(yǎng)素的偏愛和響應(yīng)度。有研究者[17，18]給予大鼠含糖為主的高能飼料，發(fā)現(xiàn)雌性大鼠體重組間差異出現(xiàn)時間較雄性大鼠更早，且體重增長量明顯高于雄性。Jen KL 等[19]喂食大鼠HFD 11 周，結(jié)果顯示，雌性大鼠未能引起肥胖評價指標(biāo)的顯著變化，雄性大鼠則在體重、脂肪含量等方面增加顯著。這一性別差異現(xiàn)象在后來的研究中[20]得到了重復(fù)。可見，雄性大鼠對高脂飼料誘導(dǎo)的增重較為敏感，而雌性大鼠則對高糖飼料響應(yīng)更佳。DIO 模型的性別差異還體現(xiàn)在脂肪分布的不同，Mayes 等[21]研究報道，雌性肥胖大鼠在皮下及生殖器周圍的脂肪墊所占比例大于雄性，而在前肢及內(nèi)臟脂肪的比例較雄性小。因此，不同性別因素在糖脂響應(yīng)度和脂肪分布等方面所造成的影響，也是DIO 研究中一個需要注意的方面。

1.1.3 年齡因素

在年齡方面，大多數(shù)研究者在大鼠剛離乳，3 周齡左右即開始投放HFD，建模周期在10-16周，致肥率為50%左右。亦有研究者[22]選用7-8 周齡，體質(zhì)量220 g左右的青年大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，持續(xù)8周左右，成功建立營養(yǎng)性肥胖模型。潘玲等[23]則選用體重在430 g 左右的成年大鼠進(jìn)行研究，4 周時大鼠體重、Lee’s 指數(shù)及腹腔脂肪含量組間差異明顯，致肥率為60%，8 周達(dá)75%，造模時間明顯縮短。Sclafani 等[17]研究指出，實(shí)驗(yàn)大鼠的生長速度隨著年齡的增長而下降，選用處于生長發(fā)育旺盛階段的幼年大鼠開始造模，在建模前期，不論是HFD 組還是投食普通飼料（regular chow diets，RCD）組的體重皆顯著增加，這在一定程度上影響了實(shí)驗(yàn)造模周期。相反地，發(fā)育基本穩(wěn)定的成年大鼠體重增加緩慢，組間呈現(xiàn)差異的時間縮短，且“飽食中樞”下丘腦腹內(nèi)側(cè)核（ventromedial hypothalamic，VMH）抑制食欲及體重增加的功能隨年齡的增長而下降[24]，這使得相同實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，成年大鼠喂飼高脂飲食的增重效應(yīng)更加明顯?？梢姡芯空咴谶M(jìn)行DIO 模型建立時，需要充分考慮在大鼠不同年齡階段投食對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響。

1.2 飼料配方

在制備食源性肥胖大鼠模型中，飼料配方的設(shè)計非常重要，可以說是模型成功與否的關(guān)鍵。有學(xué)者曾嘗試采用高碳水化合物飼料或“自助餐”飼料誘導(dǎo)大鼠肥胖模型，但由于效果不佳、配方難以標(biāo)準(zhǔn)化等原因，未被后續(xù)研究選用。1959 年，Masek[25]首次通過高脂膳食干預(yù)誘導(dǎo)了大鼠肥胖動物模型，并對高脂膳食進(jìn)行了描述。Buettner 等[26]進(jìn)一步分析不同脂肪成分對動物模型的影響，得出富含飽和脂肪酸的豬油更容易誘導(dǎo)肥胖。因而，高脂飼料配方中豬油的含量一直是研究者不斷探討的問題。

國外研究者大多選擇Research Diets、Harlan Teklad 等公司的高脂純化飼料，而國內(nèi)學(xué)者多在基礎(chǔ)飼料中添加豬油、蛋黃粉、奶粉或膽固醇等成分制成混合高脂飼料，將飼料整體脂肪含量提高到20%-40%。Wang 等[27]將高脂飼料配方中豬油含量設(shè)計為20%，造模周期持續(xù)12 周，結(jié)束時成模率為46%。湯錦花等[28]在實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)，20%豬油飼料由于含有較高的油脂，飼料松散難以成形，不適于有喜用硬物磨牙習(xí)性的大鼠，致大鼠攝食量減少，飼料大量浪費(fèi)，建模周期長且成功率低，而后將豬油含量減至15%，大鼠適應(yīng)快，食量增加，僅用8 周實(shí)驗(yàn)大鼠肥胖率即為45%。大部分研究者將飼料配方中豬油含量控制在12%，同時添加其他適口成分，這樣即維持飼料的硬度又保證脂肪供能比和配方總熱卡值，如徐姝迪等[29]適當(dāng)增加飼料中蔗糖的比例，姚榮英等[30]加入花生和麻油。少數(shù)國內(nèi)學(xué)者參照Research Diets 配方設(shè)計飼料，如 Shen 等[31]依據(jù) Research Diets-D12492 配方（60%脂供能高脂飼料）設(shè)計，Jie 等[32]參考Research Diets-D12451 配方（45%脂供能高脂飼料）等。朱磊[33]將自擬高脂飼料（豬油16.90%、脂肪供能40%）與兩種Research Diets 配方飼料進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，D12451 組建模效率最高，6 周建模成功率為40%，10 周達(dá) 67%，D12492 組 10 周肥胖率僅為 20%，而自擬高脂飼料組經(jīng)過10 周的喂養(yǎng)肥胖率為0%。可以看出，不同配方飼料的口感、成型、能量及營養(yǎng)素等均不相同，從而影響到DIO 模型的建模率和操作周期。因此，研究者設(shè)計的飼料配方在考慮高脂肪含量的同時兼顧口感及成型，對縮短造模周期、保證整個制作模型的過程更穩(wěn)定、可靠的進(jìn)行是十分必要的。

1.3 喂飼方法

在DIO 模型的制備過程中，喂飼方法也占據(jù)重要一環(huán)，尋找合適的喂飼方法是研究者提高建模成功率需要考慮的問題。Masek 等[25]采用HFD 組大鼠足量、單一投放高脂飼料，全天自由攝食飲水，成為DIO模型建造的經(jīng)典喂飼方法。而后，各學(xué)者在此基礎(chǔ)上做了不同程度的改進(jìn)。楊愛君等[34]為保證每日飼料的新鮮度，采用每日限量投食的方法，參照實(shí)驗(yàn)大鼠正常攝食量，所有實(shí)驗(yàn)對象按每只13 g/日定量投放，隨著鼠齡的增加，投料相應(yīng)增多。劉曉平等[35]則模擬人類三餐飲食模式，進(jìn)一步限制投料時間，每日分3 次供給，吃完后不再添加。為使大鼠逐漸適應(yīng)飼料豬油含量，有研究者[36]將模型組由進(jìn)食單一高脂飼料變?yōu)橄任?0%豬油飼料，2 周內(nèi)逐漸過渡到20%豬油高脂飼料；也有研究者[37]將兩種不同脂肪含量飼料在造模周期內(nèi)前后兩階段分別按比例投放。張建剛等[38]則考慮到大鼠攝食自主性對模型建立的影響，選用模型組同時給予普通飼料和高脂飼料的混合喂養(yǎng)法，由大鼠自主選擇進(jìn)食。曹翠玲等[39]則采取3 天一個循環(huán)的交替喂養(yǎng)方式，即模型組大鼠第1 天喂以普通飼料，第2、3 天喂高脂飼料，以此循環(huán)，避免大鼠因每天食用高脂飼料而引起的食欲減退。可以看出，研究者在實(shí)驗(yàn)中為使大鼠更快的適應(yīng)高脂飼料，減小長期食用對攝食量的影響而不斷改進(jìn)喂飼方法，因此，選擇合適的喂飼方法對DIO 模型的建立也非常重要。

1.4 肥胖抵抗因素

不僅不同品系大鼠對HFD 誘導(dǎo)肥胖的易感性存在差異，亦有研究[40-41]發(fā)現(xiàn)，即使是同一品系、性別和年齡的大鼠也僅部分誘導(dǎo)成功，存在部分大鼠體重增長比例相對較低，即肥胖易感和肥胖抵抗現(xiàn)象，同時證實(shí)OR 的發(fā)生率在30%左右，直接影響DIO 模型建造的成功率。目前，越來越多的研究傾向于在實(shí)驗(yàn)中分離出OR大鼠，李曉靜等[22]在給予實(shí)驗(yàn)組大鼠高脂飼料2-3 周后，剔除體重增長量位于后1/3 的大鼠，與傳統(tǒng)造模組相比，實(shí)驗(yàn)組致肥率高達(dá)66.7%，這表明去除OR 大鼠有助于提高致肥率。也有研究者[42]選取在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)逐步淘汰體重增長緩慢的大鼠的方法，使不同肥胖表型反應(yīng)得更加準(zhǔn)確。那立欣等[43]在研究中指出，剔除OR 大鼠后建造的肥胖模型體重、體脂含量等模型評價指標(biāo)都顯著高于傳統(tǒng)模型中的肥胖大鼠，更具典型性和代表性，同時可節(jié)省喂養(yǎng)周期內(nèi)的實(shí)驗(yàn)成本。上述研究顯示，OR 因素對致肥率的影響是研究者在模型制備中需要考慮到的。

1.5 建模持續(xù)時間

DIO模型建立持續(xù)的時間一直是科研工作者建立DIO 模型時較為關(guān)注的問題，持續(xù)時間的不同直接影響著不同肥胖并發(fā)癥的出現(xiàn)。Andrich等[44]給予Wistar大鼠2周HFD，結(jié)果僅體內(nèi)脂肪含量存在組間差異，體重組間差異不明顯，證明2 周不足以誘導(dǎo)DIO 大鼠的出現(xiàn)。部分研究者[34，35]實(shí)驗(yàn)周期持續(xù)6周，實(shí)驗(yàn)組體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)和體內(nèi)脂肪重量均高于RCD 組，肥胖表型明顯。Sripradha R 等[45]給予雄性Wistar大鼠10周含脂量30%的高脂飼料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高脂飲食導(dǎo)致大鼠血漿中TC、TG、LDL-C 和MDA含量升高，而HDL-C 含量出現(xiàn)顯著性下降。Amin 等[46]采用含脂量35%的高脂飼料喂飼大鼠12 周，發(fā)現(xiàn)HFD 組大鼠在血液脂代謝紊亂的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步出現(xiàn)血漿NO 含量降低，血糖升高和胰島素抵抗現(xiàn)象。這提示研究者在評估干預(yù)措施對營養(yǎng)性肥胖不同繼發(fā)癥的療效時，一定要考慮模型建立周期的影響。

2 討論與總結(jié)

近年來，隨著國內(nèi)外營養(yǎng)性肥胖患者的不斷增多，對肥胖發(fā)病機(jī)制研究和有效干預(yù)措施作用機(jī)制的需求愈加迫切。由于建立DIO 大鼠模型涉及多因素影響，致使模型的成功率不高，穩(wěn)定性及可重復(fù)性難以保證，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)的可信度，且不利于不同研究結(jié)果間的比較和分析。基于現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)研究，本研究初步分析DIO 大鼠模型建立的相關(guān)影響因素（見表1），以期為后續(xù)研究提供一些新的思路，見表1。

在大鼠的選擇方面，品系對比研究[14，15]表明，Wistar大鼠不論在體質(zhì)量增加還是體內(nèi)脂肪堆積都優(yōu)于同期SD大鼠，且Wistar大鼠被證實(shí)對飼料中脂肪含量變化反應(yīng)靈敏[47]，更適合于DIO 動物模型研究。在大鼠年齡的選擇方面，如前所述，成年大鼠體重增長緩慢，同時伴有VMH 功能下降，因此，選用成年大鼠模擬的肥胖模型存在VMH 病變的影響，雖然模型建立周期短、效率高，但產(chǎn)生的肥胖表型不完全由飲食誘導(dǎo)，故不能充分代表單純的人類營養(yǎng)性肥胖。肥胖流行病學(xué)調(diào)查[1]顯示，約1/2 成年肥胖者有幼年肥胖史。選用離乳3 周齡大鼠造模，未經(jīng)前置普通飼料干擾，幼年期單純的高脂飲食引起飲食模式、能量代謝水平等的改變可造成大鼠對高脂食物的感官偏嗜，且程序性影響整個生命進(jìn)程中機(jī)體代謝的調(diào)節(jié)和體質(zhì)量的變化，雖然存在相對較長的造模周期，但更全面的模擬了人類營養(yǎng)性肥胖的行為特點(diǎn)和感官特征，故適宜于DIO 模型的實(shí)驗(yàn)研究[48]。性別方面，雄性大鼠更適合DIO 模型研究。一方面因?yàn)槠鋵︼暳现兄境煞趾湍芰棵芏茸兓母呙舾行裕硪环矫鎰t結(jié)合大鼠的生理特點(diǎn)，雌性大鼠在成年早期體重趨于穩(wěn)定且每4-6 天重復(fù)的發(fā)情期會影響攝食量，若造模周期較長，雄性大鼠能有更顯著的體質(zhì)量和脂肪含量[49]。

在飼料組成方面，目前國內(nèi)自制高脂飼料種類較多，配方構(gòu)成偏重于食物的成型、適口性及能量構(gòu)成，雖然熱卡值高但能量不均衡，且配置中易造成飼料中營養(yǎng)素如蛋白質(zhì)被稀釋，從而導(dǎo)致效果良莠不齊，直接影響建模成功率[50]。Research Diets、Harlan Teklad等公司的高脂純化合成飼料以蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素、礦物鹽等不同化合物為原料，按照不同營養(yǎng)素的質(zhì)量和能量比例進(jìn)行配置，不僅脂肪供能比高，且注重營養(yǎng)素和能量之間的平衡，使大鼠在滿足正常生長發(fā)育需求的同時攝取更多的熱量來誘導(dǎo)肥胖。綜合考慮營養(yǎng)素、能量、口感及成型等因素，并結(jié)合朱磊等[33]研究結(jié)果，認(rèn)為脂肪供能45%的Research Diets D12451 更適合于DIO 模型的研究，且配方統(tǒng)一，各研究間可比性更好。

關(guān)于喂飼方法的選擇，首先需要結(jié)合大鼠的攝食規(guī)律。DIO大鼠的攝食行為特點(diǎn)常表現(xiàn)為單餐進(jìn)食量增多和攝食頻率減少，進(jìn)食頻率和攝食量在夜晚的開始和接近結(jié)束時達(dá)到高峰。限制喂飼法在每日投食量上不易把控，且限時、限量的飲食模式難以滿足DIO大鼠的單餐攝食量和感官享受[51]。此外，由于同時對空白組的飲食限制，可能會出現(xiàn)較早的組間體重差異，但在周期內(nèi)HFD 組未攝入足量的高脂飼料，直接影響模型的穩(wěn)定性及可靠性。因此，每日足量投放，自由攝食仍是首選。其次，需要注意大鼠對HFD 的適應(yīng)過程。在DIO 模型建立初期和喂食高脂飼料一段時間后，模型組大鼠常會出現(xiàn)食欲較空白組差的現(xiàn)象，此時可根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件，采用不同脂肪含量飼料過渡喂養(yǎng)或短暫RCD與HFD交替喂養(yǎng)的方法，在增進(jìn)食欲的同時，盡量減少組間喂養(yǎng)方式的差異對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響?；旌衔桂B(yǎng)法雖給予大鼠自主擇食的權(quán)利，但離乳后暴露于HFD 產(chǎn)生的嗜糖脂性可能造成大鼠日RCD攝取量減少，影響DIO模型的建立。

在肥胖抵抗效應(yīng)方面，研究者可選擇于實(shí)驗(yàn)前期2-3 周內(nèi)剔除體重增長量靠后的大鼠，或在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)逐步淘汰體重增長緩慢的大鼠來確保建模成功率，降低實(shí)驗(yàn)成本。但值得重視的是，若進(jìn)行OP 和OR 的機(jī)制研究，則需要注意篩選的時間以及OP、OR模型的評判標(biāo)準(zhǔn)，在實(shí)驗(yàn)早期僅能做到初步的分離和篩選，并不能完全保證OP和OR模型的精確性。

在建模持續(xù)時間方面，研究者應(yīng)根據(jù)實(shí)際研究目的確定模型建立所需時間的長短。研究證實(shí)，短期喂養(yǎng)難以充分誘導(dǎo)食源性肥胖模型[44]。有學(xué)者[33]提出，喂飼6 周是利用45%脂供能高脂飼料構(gòu)建SD 大鼠肥胖模型最經(jīng)濟(jì)的建模周期，肥胖并發(fā)的糖脂代謝紊亂需要9-10 周左右才能穩(wěn)定形成[42]。若進(jìn)一步延長造模時間，血液中膽固醇濃度繼續(xù)升高，極易合并動脈粥樣硬化等血管病變，對手術(shù)等損傷性操作耐受性差，導(dǎo)致后續(xù)基礎(chǔ)研究可操作空間小[31]。除此之外，也有學(xué)者[52]因成功率不理想而延長建模周期，雖然增加了DIO 模型的數(shù)量，但在自由采食情況下，對照組大鼠也會隨著時間推移出現(xiàn)體脂積累，向肥胖狀態(tài)發(fā)展，這樣降低了建模效率，增加實(shí)驗(yàn)成本。所以，當(dāng)研究者選擇延長造模周期時，需要綜合考慮研究目的、建模效率、實(shí)驗(yàn)成本以及大鼠不斷惡化的體質(zhì)對后續(xù)機(jī)制研究帶來的影響。

表1 食源性肥胖大鼠模型制備中主要影響因素及建模成功率

綜上所述，DIO 大鼠模型建立過程中易受多種因素影響，針對上述因素，本研究結(jié)合現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)研究也初步提出了相關(guān)建議，但最重要的參考依據(jù)還是所要研究的目的，即要根據(jù)研究目的來制訂具體建模方案。此外，這僅僅只是整個模型建造中影響因素的一部分，對于本研究所發(fā)現(xiàn)的其他因素，如DIO 模型的判斷標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)環(huán)境、光照時間、濕度等有待后期研究進(jìn)一步查證與規(guī)范。因此，充分認(rèn)識多因素對模型制作的影響，構(gòu)建穩(wěn)定、可靠的動物模型并合理應(yīng)用，才能更好地開展針刺干預(yù)肥胖病的基礎(chǔ)研究。