慢性萎縮性胃炎病證結合模型大鼠肝組織病理及功能變化＊

李 諾，李依聰，張 瑋，衛博文，蘇澤琦，丁 霞，李 健＊＊

（1. 北京中醫藥大學中醫學院組織胚胎學教研室 北京 102488；2. 北京中醫藥大學附屬東直門醫院 北京100700；3. 北京中醫藥研究院 北京 100029）

慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）是以胃黏膜腺體萎縮、減少為主要特征的消化性疾病，如果得不到及時有效治療，可發展為胃癌前病變（precancerous lesions of gastric cancer，PLGC）進而轉變成胃癌（gastric carcinoma，GC）[1]。早期胃癌的臨床隱匿性較高，多數患者確診時已處于中晚期，治療和預后均不理想。因此，在慢性萎縮性胃炎階段積，極有效的干預治療成為防治胃癌前病變及胃癌發生、降低胃癌死亡率的重要措施[2]。

中醫學無CAG 的名詞，可歸屬為“胃痞”“胃脘痛”“反酸”“嘈雜”等范疇，其病因復雜多樣，通常與外感六淫邪氣、飲食內傷、情志失調、勞逸過度、素體脾胃虛弱等單一或者綜合因素有關。臨床觀察發現，脾虛證是CAG 最常見的證候類型，且貫穿整個病程[3]。以健脾為主的中醫治法及方劑對CAG 的治療有確切的臨床療效[4]，其作用機制亟待揭示。然而，因為缺少穩定可靠的脾虛CAG 病證結合動物模型，與之相關的中醫基礎理論內涵、方劑作用原理等研究很難深入。

通常意義上的實驗動物模型是指疾病分類指導下的單純疾病模型，缺少中醫證候因素，很難照搬使用到中醫藥作用機制的研究中。因此，病證結合動物模型的研制成為新醫學時代科學研究的關鍵環節。本課題組在已有文獻資料的基礎上，創建了CAG“四因素”綜合造模法，即N-甲基-N-硝基-亞硝基胍（MNNG）為主、疊加雷尼替丁、水楊酸鈉、饑飽失常四個因素，成功制備了CAG 病證結合動物模型[5-6]。該方法不僅縮短了造模時間，而且提高了模型復制的成功率。

中醫學認為，“脾”是臟象學說中的重要組成部分,是脾胃學說的核心[7]。探討“脾”的本質，己成為繼承和發展祖國醫學的重要課題。“脾”乃氣血生化之源，后天之本，脾虛則運化不利，水谷精微輸布失常。同時，脾與五臟六腑在功能上相互影響，《脾胃論》曰：“元氣之充足，皆由脾胃之氣無所傷，而后能滋養元氣；若胃氣之本弱，飲食自倍，則脾胃之氣既傷，而元氣亦不能充，而諸病之由生也”，這說明脾病會引起很多臟器系統的病變。現代醫學認為，“脾”不僅與食物的消化、吸收和轉輸精微（谷精）有關，還涉及消化、內分泌、免疫、代謝等多系統和臟器，尤其與消化系統功能和能量代謝密切相關。肝臟作為人體最大的實質器官，參與食物消化吸收，糖、脂代謝等過程。脾虛時，肝臟出現一系列病理和功能改變，有研究表明[8]，脾虛時肝臟蛋白激酶C（PKC）活性明顯升高，從而促進糖原代謝；脾虛大鼠肝組織線粒體功能、結構、數量等改變，導致能量代謝障礙[9-10]。

在前期工作的基礎上，本研究擬探討CAG 病證結合模型大鼠肝臟功能及組織病理學的變化特征，為CAG 的本質以及脾虛與肝臟之間關系的研究提供實驗資料和新思路。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

Wistar 大鼠，雄性，30 只，體重（80±10）g，購自北京斯貝福實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2014-0010，飼養于北京中醫藥大學實驗動物中心（SPF級）。動物實驗方案經北京中醫藥大學實驗動物倫理委員會審批通過。

1.2 試劑與耗材

N-甲基-N-硝基-亞硝基胍（MNNG），購于梯希愛（上海）化成工業發展有限公司（貨號M0527），水楊酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號30169317），鹽酸雷尼替丁膠囊（石藥集團歐意藥業有限公司，批號：331131001）。電鏡樣品制備及石蠟切片、過碘酸-Schiff試劑、硝基藍四氮唑、HE染色相關試劑和耗材均購自北京益利精細化學品公司。丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）試劑盒，購自南京建成生物工程研究所（貨號：C00921和C001021）。

2 實驗方法

2.1 CAG病證結合大鼠模型制備及評估

CAG 病證結合大鼠模型制備按照本課題組已有方法[5-6]，簡要敘述如下：Wistar 大鼠 30 只，隨機分為 2組（正常對照組10 只，模型組20 只）。采用以MNNG為主的“四因素”綜合造模方法處理模型組大鼠。在造模28周時，采用中醫診斷學的方法記錄大鼠的行為學和形態特征（量表見附件）。以大鼠出現懶動、食少、形體消瘦、大便濕潤或者稀溏、爪色淡白少光澤不潤的程度評分。進而從中抽取10只大鼠，取胃和肝組織行相關指標的檢測。40周時停止造模，重復上述工作。表征比率為陽性表征數與總數之比。

2.2 血清ALT和AST水平檢測

造模28 周和40 周時，將待觀察和取材的動物禁食24 小時（自由飲水）。2%戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g）腹腔注射麻醉后，經腹主動脈取全血，靜置30 min后，離心獲取血清（3000 r·min-1，10 min），用全自動生化儀檢測血清中ALT、AST含量。

2.3 胃和肝組織病理學檢測

切取大鼠胃體和肝大葉組織，一部分行常規石蠟包埋、切片、HE 染色；另一部分肝組織，行常規冰凍切片、組化顯色。其中，過碘酸-Schiff試劑（PAS）顯示肝細胞內糖原的分布，硝基藍四氮唑（NBT）顯示肝細胞內琥珀酸脫氫酶（SDH）的分布。組織病理切片用光鏡觀察、攝片。

2.4 肝組織超薄切片透射電鏡觀察

切取1 mm×1 mm×2 mm 肝組織，經預冷的2.5%戊二醛固定12 h，1%鋨酸雙重固定2～3 h 后，行常規脫水、Epon812環氧樹脂包埋、超薄切片、醋酸鈾-檸檬酸鉛電子染色、透射電鏡觀察、攝片。

2.5 數據分析及統計學處理

采用SPSS20.0 統計軟件進行數據分析，并用Graphpad Prism5.0 軟件作圖。所有計量資料以均值±標準差（）表示，資料分析前進行正態性檢驗。多組間比較采用單因素方差分析（One-Way-ANOVA），如果方差齊，則用LSD 法和Dunnett 進行分析；若方差不齊，則用Tamhane′s T2進行分析。P＜0.05為有統計學意義。計數資料數據以率表示，組間比較用卡方檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 CAG病證結合大鼠模型評估結果

造模20周大鼠胃組織病理學檢測結果表明，胃黏膜層腺體數量減少、胃壁固有層變薄、未見腸化和異型增生改變，研究結果提示：造模20 周大鼠處于慢性萎縮性胃炎病理階段，與課題組前期的實驗結果一致。造模32周時模型組大鼠胃壁顯著變薄，胃腺數量顯著減少，伴有明顯的腸上皮化生和異形增生病變，提示：造模32 周大鼠呈胃癌前病變病理階段（結果未展示，見本課題組發表論文[11]）。

脾虛證測評結果（見表1）可知：造模28 周大鼠偏嗜睡懶動、眼睛暗紅、毛干枯晦暗、爪淡白、唇淡白、舌紫黯、舌少澤不潤，大便不成形，與正常對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），可評估為脾氣虛證；而造模40周大鼠偏嗜睡懶動、耳朵暗紅、眼睛暗紅、毛干枯晦暗、爪青紫、尾巴黃有瘀點、唇青紫、舌紫黯、舌少澤不潤、大便不成形的證候，與正常對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），特點以脾虛為主，兼有血瘀。

3.2 大鼠血清ALT、AST含量檢測結果

與正常組比較，造模28 周時大鼠血清ALT 和AST水平顯著增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與造模28 周比較，造模40 周大鼠血清ALT 水平仍顯著增高，差異有統計學意義（P＜0.05），而AST水平沒有顯著改變，如圖1。

3.3 大鼠肝組織病理學檢測結果

肝組織石蠟切片、HE 染色結果表明，正常大鼠肝小葉結構完整，肝細胞索呈放射狀排列整齊，肝細胞形態正常，見圖2A；造模28 周時，肝細胞索排列紊亂，肝細胞腫脹，如圖2B；造模40 周時，肝細胞萎縮，肝血竇變小，炎性細胞數量增多，見圖2C。肝組織冰凍切片過碘酸-Schiff 顯色，肝糖原呈紅紫色。染色結果表明，正常大鼠肝細胞糖原分布均勻，見圖2a；造模28周時，肝組織呈現斑狀糖原缺失區，見圖2b；造模40 周時，肝組織糖原缺失區顯著擴大，見圖2c。肝組織冰凍切片NBT 顯色，琥珀酸脫氫酶呈藍紫色顆粒。染色結果表明，正常大鼠肝組織著色均勻、染色深，見圖2i；造模28 周時，肝小葉中央靜脈周圍細胞著色變淺，提示琥珀酸脫氫酶含量減少，見圖2ii；造模40 周時，肝組織整體著色淺，中央靜脈周圍顏色更加淺淡，提示琥珀酸脫氫酶含量顯著減少，見圖2iii。

表1 脾虛CAG模型大鼠證候量化表征比率統計結果(n=10)

圖1 大鼠血清ALT和AST水平檢測結果(,n=10)

3.4 大鼠肝組織超薄切片透射電鏡觀測結果

透射電鏡觀察，正常組大鼠肝細胞電子染色均勻，細胞核大而圓、核膜完整，胞質內有豐富的線粒體、內質網和糖原顆粒，見圖3A。造模28 周時，肝細胞內線粒體腫脹、變形，內質網減少，糖原顆粒減少，胞質內出現空泡樣改變，見圖3B；造模40 周時，肝細胞內線粒體腫脹、膨大、數量顯著減少，內質網顯著減少，糖原顆粒數量顯著減少，見圖3C。

圖2 大鼠肝組織病理改變光鏡觀察結果（×400，標尺示100 μm）

圖3 肝組織透射電鏡觀察結果（×10000）

4 討論

CAG 病因復雜、臨床癥狀無特異性，現代醫學對CAG尚無療效肯定的治療方案[12]。中醫學基于辨證論治、病證結合理論，對CAG 有理想的療效，不僅緩解臨床癥狀，而且顯著改善病變程度和進展。通過臨床觀察及查找相關文獻發現，慢性萎縮性胃炎根據臟腑辨證方法辨出的證型當中屬脾胃虛弱型最多見。丁成華等[13]以中醫理論為基本點，將文獻研究與數據挖掘相結合，對2000-2010 年間發表在中國知網和維普中文期刊數據庫的文獻整理篩選，從中選出符合標準的7317 例病例進行回顧性研究分析，初步了解證候分布情況，方法上以中醫藥為主診治慢性萎縮性胃炎的文獻進行整理，總結證候出現頻率大小依次為：脾胃虛弱證＞肝胃不和證＞脾胃濕熱證＞胃陰不足證＞胃絡瘀血證，其中脾胃虛弱證出現頻率最高，占36.27%，說明脾胃虛損是最主要的病機。鄭保平[14]認為，“脾胃虛弱”為慢性萎縮性胃炎（CAG）及其癌前病變的發病之本，基本證型有脾胃氣虛、脾胃虛寒、脾胃陰虛；“邪踞胃脘、久釀成毒”是CAG 及其癌前病變發展、演變的病理基礎和關鍵因素，常見證型有濕熱中阻、痰濕困脾、氣滯血瘀；“脾（胃）肝同病”是CAG 及其癌前病變必然的病機特征；“脾虛及腎”是CAG 及其癌前病變病機演變的轉歸，有脾腎陽虛、肝腎陰虧兩型；“脾虛絡阻、虛實夾雜”是貫穿CAG 及其癌前病變始終的基本病機。宗湘裕等[15]將CAG 辨證分為脾胃虛弱證、脾胃濕熱證、肝胃不和證、胃陰不足證、胃絡瘀血證。脾胃虛弱證偏多而胃絡瘀血證偏少可能與CAG 發展階段有關。

然而，因缺少穩定可靠的中醫CAG 病證結合動物模型，中醫藥治療CAG 的作用機制尚不明確。脾虛證動物模型是最早被研究的中醫證候模型之一。研究者采用苦寒泄下、耗氣破血、勞倦過度、限量營養、藥物處理（利血平、硝酸鈷、水楊酸鈉）等方法成功的制備了脾虛證實驗動物模型[16-19]。在臨床實踐中，“病、證、癥”三者相互依存、同步演化，割裂“病、證、癥”之間聯系的動物模型顯然不能滿足中醫理論內涵及方劑作用原理等研究的需要。

本課題組采用MNNG 為主的“四因素”綜合造模法，通過改進造模因素之間組合方式，縮短造模時間的同時也提高了模型成功率。然而，CAG 大鼠肝功能及組織病理學的變化尚未受研究者關注，相關實驗研究仍是空白。本課題探討了造模28 周、40 周CAG 病證結合模型大鼠肝功能及肝組織病理學的變化規律，研究結果顯示：CAG 大鼠肝功能受到一定影響，肝糖原合成和儲備能力下降，肝細胞線粒體腫脹、變性、氧化磷酸化作用受到影響。從文獻中得知，脾虛證大鼠肝糖原明顯低于正常大鼠[20]，葡萄糖激酶（CK）mRNA表達水平下降，CK 活性下降,導致肝糖原合成減弱,分解加速,糖異生增強,并減少了肝臟和其他外周組織對葡萄糖的攝取和利用,從而使肝葡萄糖輸出增加[21]；SDH 是糖有氧氧化的關鍵酶,位于線粒體內膜上的一種膜結合酶，是鏈接電子呼吸傳遞和氧化磷酸化的樞紐之一。實驗性脾虛證大鼠肝組織SDH 含量降低，氧化磷酸化效率下降，可能和線粒體結構、功能破壞密切相關[22]。上述形態變化直接影響肝臟物質代謝和能量代謝的平衡，影響機體營養物質的輸布和能量的供給，誘發機體一系列生理、生化功能失衡，能部分解釋中醫脾虛證的臨床表現。

脾虛證實質的研究一直是熱點研究領域，各種學術觀點碰撞、交匯，至今仍是一片迷惘。已有的研究并未局限于脾與消化系統的關系，涉及免疫、內分泌、線粒體、人體正常菌群等各個方面，使得中醫脾的概念更泛化和復雜[23-25]。從另外角度，本研究證實，脾虛影響肝臟物質代謝功能，為中醫臨床從脾論治相關疾病提供了實驗資料。從這個意義上，基于病證結合動物模型，研究者能更好的探究脾虛證的“物質—能量—信號轉導”規律，有助于研究中醫脾實質及健脾方劑的作用原理。