兩種嶺南濕熱證小鼠模型腸道菌群動(dòng)態(tài)變化的研究＊

陳 弋，王 琛，徐秋英，林興棟，皮立宏，吳智兵，謝淑瑩

（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 廣州 510405；2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)研究中心 廣州 510405；3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院 廣州 510378；4. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 廣州 510405；5. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 廣州 510405）

濕熱證是嶺南地區(qū)常見的證候類型。目前在該研究領(lǐng)域，使用細(xì)菌[1-2]、內(nèi)毒素[3]、病毒[2,4]、脂多糖（LPS）[5-6]等致病因素，配合飲食、環(huán)境因素影響進(jìn)行“病證結(jié)合”的復(fù)合多因素造模方式已較為成熟，但評(píng)判動(dòng)物模型建立的成功與否，仍以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物能否基本復(fù)制臨床濕熱證的癥候?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)，尚缺乏統(tǒng)一的客觀化指標(biāo)。腸道菌群作為一種非侵入性的生物標(biāo)志及具有前景性的藥物作用靶點(diǎn)，具有應(yīng)用于嶺南濕熱證的模型研究的潛力。有研究[6]報(bào)道，使用LPS作為致病因素建立的濕熱證小鼠模型存在腸道菌群的變化，但尚未見在不同致病因素作用下濕熱證小鼠模型腸道菌群動(dòng)態(tài)演變的相關(guān)研究。本研究旨在通過(guò)對(duì)兩種不同致病因素作用下（LPS和大腸桿菌）對(duì)建立的嶺南濕熱證小鼠模型腸道菌群動(dòng)態(tài)變化規(guī)律進(jìn)行探討，從微生態(tài)角度發(fā)掘客觀化建模指標(biāo)，既可賦予傳統(tǒng)中醫(yī)證候?qū)W說(shuō)新的微生態(tài)學(xué)內(nèi)容，也為濕熱證的現(xiàn)代證候生物學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供新的思路，為嶺南濕熱證的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

18-22 g SPF 級(jí)雄性 BALB/c 小鼠 52 只，購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證明編號(hào)為No.44005800010502。

1.1.2 飼料

高脂飼料D12451 由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，總能量4.73 kal/g，脂肪功能比45%，具體組成為：蛋白24%、碳水化合物41%、脂肪24%。普通小鼠飼料由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.3 菌種、藥物及試劑

腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（EnterotoxigenicEscherichia coli，ETEC）（鄭州精思威化工有限公司，菌種編號(hào)：bio-56937）；麥康凱培養(yǎng)基、LB 固體培養(yǎng)基由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；蔗糖（廣東廣試試劑科技有限公司，批號(hào)：2019010109）；LPS 凍干粉（美國(guó)Sigma 公司，貨號(hào)：L2880）；糞便基因組DNA 提取試劑盒（Tiangen 公司，貨號(hào)：DP328-02）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript ?RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)（Takara 公司，貨號(hào)：RR047A）；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 試劑盒 TB Green? Premix Ex Taq ? II(Tli RNaseH Plus)（Takara 公司，貨號(hào)：RR820A）；PCR 引物（生工生物工程（上海）股份有限公司）。

1.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器

RXZ-160型人工氣候箱（寧波江南儀器廠）；SPX-100B-Z型生化培養(yǎng)箱（上海博迅）；麥?zhǔn)媳葷峁埽◤V州環(huán)凱）；NANO DROP 2000超微量紫外/可見分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo）；H1干式恒溫儀（珠海Hema）；2720型熱循環(huán)儀（美國(guó)ABI）；7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI）；IX73倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Hittich）；超低溫保存箱（青島Haier）；生物安全柜（HF safe）；LMQ.C立式滅菌器（山東新華醫(yī)療）。

1.2 方法

1.2.1 菌液及溶液制備

1.2.1.1 大腸桿菌菌液制備

ETEC經(jīng)麥康凱培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)24 h后采用LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑取第5 代菌落至無(wú)菌生理鹽水中混懸，參照文獻(xiàn)[2]采用麥?zhǔn)媳葷岱y(cè)得濃度為109·mL-1，現(xiàn)配現(xiàn)用，按0.04 mL·g-1的劑量灌胃感染小鼠，24 h后重復(fù)感染一次。

1.2.1.2 LPS溶液制備

將LPS凍干粉用生理鹽水配制為濃度為1 mg·mL-1的溶液，分裝后置于-20℃冰箱保存待用；使用時(shí)用生理鹽水將其濃度稀釋為0.1 mg·mL-1，現(xiàn)配現(xiàn)用，參照文獻(xiàn)[6]按1 mg·kg-1的劑量腹腔注射小鼠。

1.2.1.3 蔗糖溶液制備

將蔗糖結(jié)晶粉末用超純水配制成20%蔗糖溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 動(dòng)物分組及造模方法

實(shí)驗(yàn)小鼠在ABSL-2實(shí)驗(yàn)室中適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為6 組，分別為：正常組（A1）、正常環(huán)境+ETEC 組（A2）、正常環(huán)境+LPS 組（A3）、濕熱環(huán)境組（B1）、濕熱環(huán)境+ETEC 組（B2）、濕熱環(huán)境+LPS 組（B3）。A 組（A1、A2、A3）置于ABSL-2 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)（室溫21-24℃，濕度55%左右），飼喂SPF 級(jí)普通飼料，自由攝食及飲水。B 組（B1、B2、B3）置于人工氣候箱（溫度30.5-31.5℃，濕度85%-95%），每日連續(xù)10 h，飼喂高脂飼料，自由攝食及飲用20%蔗糖溶液，連續(xù)造模20天。造模第20 天，A2、B2 組小鼠灌服大腸桿菌菌液，24 h 后重復(fù)感染 1 次；A3、B3 組小鼠腹腔注射 LPS 溶液。小鼠灌胃或腹腔注射后繼續(xù)每日放于人工氣候箱內(nèi)10 h，密切觀察10天。

1.2.3 模型評(píng)價(jià)及觀察指標(biāo)

從造模開始觀察并記錄模型小鼠的體重、進(jìn)食量、精神狀態(tài)、活動(dòng)度、形體、被毛、爪、尾、肛門情況、二便性狀等癥狀、體征變化，參照文獻(xiàn)[6-8]判斷濕熱證小鼠模型建立成功與否，并按癥狀無(wú)、輕、中、重程度分別記為0、1、2、3分（見表1）。每隔5天統(tǒng)計(jì)小鼠的癥狀積分。

表1 嶺南濕熱證小鼠模型癥狀積分明細(xì)

1.2.4 樣本的采集

1.2.4.1 小鼠糞便樣品的采集

采用逼迫法收集干凈的小鼠糞便至無(wú)菌EP 管中，每管收集180-200 mg 并置于冰中運(yùn)輸，于糞便采集時(shí)間起2 h 內(nèi)存于-80℃冰箱。采集時(shí)間點(diǎn)為：造模前，造模第5、10、15、20、21、22、25、30 天。糞便采集應(yīng)于腹腔注射執(zhí)行之前。

1.2.4.2 結(jié)腸標(biāo)本的采集

造模第30天收集糞便后處死小鼠，取小鼠結(jié)腸組織，從回盲部下1 cm 處開始剪取，剪出0.6-0.7 cm，用冰鹽水小心清除腸內(nèi)容物后快速泡于4%多聚甲醛中常溫保存。剩余結(jié)腸組織用預(yù)冷生理鹽水清洗后在濾紙中吸掉殘余液體，于-80℃冰箱中保存待檢。

1.2.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.2.5.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)腸道菌群

收集小鼠不同時(shí)間點(diǎn)的糞便后，按照糞便基因組DNA 提取試劑盒說(shuō)明書提取菌群DNA，存于-20℃冰箱備用。查閱相關(guān)文獻(xiàn)[6,9]獲取引物序列，并在BLAST基因庫(kù)內(nèi)比對(duì)引物特異性。各引物序列靶基因?yàn)?6S rDNA，引物序列及PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見表2。

按照PCR 試劑盒說(shuō)明書配制20 μl 反應(yīng)體系，以TB Green 為熒光信號(hào)采用兩步法擴(kuò)增目的基因，具體程序?yàn)椋侯A(yù)變性 95℃ 30 s，PCR 反應(yīng) 95℃ 5 s、60℃ 34 s，循環(huán) 40 次；熔解曲線階段 95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃15 s。收集熒光信號(hào)后根據(jù)熔解曲線分析PCR產(chǎn)物的特異性，由ABI 7500 Software v2.0.6 計(jì)算每孔CT值，根據(jù)CT 值采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)含量。每個(gè)樣品設(shè)置2個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次。

1.2.5.2 結(jié)腸病理切片觀察形態(tài)學(xué)改變

小鼠結(jié)腸組織經(jīng)多聚甲醛固定后予脫水包埋，制作HE染色切片，顯微鏡下觀察結(jié)腸組織的形態(tài)學(xué)變化。

1.2.5.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)腸組織中腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）基因表達(dá)

取50-100 mg 結(jié)腸標(biāo)本液氮研磨，加入Trizol、氯仿、異丙醇等提取RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒去除基因組DNA后，冰上配制20 μl反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，合成cDNA模板，存于-20℃冰箱備用。以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)各組結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6 mRNA的表達(dá)水平。具體反應(yīng)程序同腸道菌群的PCR反應(yīng)程序，擴(kuò)增引物序列見表3。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次，以2-ΔΔCt法計(jì)算各目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)類型均為計(jì)量資料，運(yùn)用SPSS 26.0 和GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析方法，數(shù)據(jù)滿足球形假設(shè)無(wú)須校正，直接進(jìn)行主體內(nèi)效應(yīng)檢驗(yàn)（一元方差分析）；不滿足球形假設(shè)則用Greenhouse-Geisser 校正自由度，采用多變量檢驗(yàn)分析，參考一元方差分析結(jié)果；當(dāng)不同處理組與不同時(shí)間上的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，運(yùn)用Bonferroni 法進(jìn)行多重比較。非重復(fù)測(cè)量的數(shù)據(jù)，若滿足方差齊性，采用單因素方差分析；不滿足方差齊性，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Bonferroni 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物數(shù)量

52 只 BALB/c 小鼠，其中 B2 組 2 只因操作不當(dāng)分別于造模第22、23 天死亡，死亡率為3.85%，本實(shí)驗(yàn)最終納入50只進(jìn)入結(jié)果分析。

表2 腸道菌群實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異引物

表3 TNF-α、IL-6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異引物

2.2 一般情況觀察

造模前各組小鼠一般情況良好，反應(yīng)靈敏，皮毛柔順有光澤，致密整齊且緊貼身體，糞便黑褐色呈麥粒狀。隨著實(shí)驗(yàn)開展，B 組（B1、B2、B3）小鼠進(jìn)食減少，其糞便總體較A 組（A1、A2、A3）濕軟臭穢，置于濾紙上可見糞便周圍有少量水痕，部分小鼠糞便夾有白色黏稠液體。造模第20 天各組給予相應(yīng)的致病因子后，A3、B3 組小鼠精神萎靡不振，喜扎堆，明顯嗜臥懶動(dòng)，聳毛，被毛無(wú)光澤，納呆，黏液便，個(gè)別小鼠出現(xiàn)便溏；A2、B2 組小鼠活動(dòng)度減少，被毛無(wú)光澤，納呆，亦可見糞便濕軟及黏液便，但精神狀態(tài)優(yōu)于A3、B3 組，B2 及B1 組部分小鼠在排便過(guò)程中出現(xiàn)肛門脫垂現(xiàn)象。3 天后 A2、A3 組小鼠恢復(fù)正常，B2、B3 組小鼠除精神狀態(tài)、活動(dòng)度好轉(zhuǎn)外，糞便濕軟、黏液便等癥狀仍持續(xù)存在。從造模第25 天開始，B 組小鼠逐漸出現(xiàn)耳紅、爪紅及肛門紅腫充血，耳紅、爪紅現(xiàn)象以B1組最為明顯。根據(jù)現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)小鼠的濕熱證證候診斷標(biāo)準(zhǔn)，至第25 天B2、B3 組建模成功，濕熱癥狀持續(xù)3 天以上。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，B2、B3 組小鼠仍有糞便濕軟、黏液便現(xiàn)象，以B2組更為明顯。

2.3 癥狀積分

小鼠癥狀積分隨著時(shí)間變化（F=162.308，P＜0.01），不同時(shí)間小鼠癥狀積分因干預(yù)因素的變化而變化（F=3.859，P＜0.01），各組積分不全相同（F=87.34，P＜0.01），總體 A 組與 B 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），B2、B3 組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.099＞0.05）。見表 4、圖 1，與 A1 組相比，B 組在造模前 10 天癥狀積分小幅增高（P＜0.05）后下降至正常水平（P＞0.05），給予相應(yīng)的致病因子后B2、B3 組小鼠癥狀積分升高且后續(xù)積分在較高水平波動(dòng)（P＜0.05）。隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展，B1 組小鼠的癥狀積分也逐漸上升（P＜0.05）。A3 組在攻毒后癥狀積分可達(dá)高峰（P＜0.05），但3 天后即降為0分并維持在低水平（P＞0.05）。

表4 不同時(shí)間段各組小鼠癥狀積分（分）

圖1 各組小鼠癥狀積分變化

2.4 腸道菌群實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量PCR檢測(cè)結(jié)果

2.4.1 各組間同種細(xì)菌變化趨勢(shì)的比較

2.4.1.1 大腸桿菌屬

各組大腸桿菌屬含量隨著時(shí)間變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=72 967.12，P＜0.01），且從不同時(shí)間點(diǎn)上測(cè)得的含量因干預(yù)因素的不同而改變差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.246，P＜0.01），總體不同組別大腸桿菌屬含量不同（F=81.778，P＜0.01）。見表5，圖2-1，B組小鼠糞便中大腸桿菌屬含量先降低后增多，在造模第20 天予相應(yīng)的致病因素后A2、B2、B3 組大腸桿菌屬含量顯著增多（P＜0.05），在造模第25 天后逐漸降低。

2.4.1.2 擬桿菌屬

各組擬桿菌屬含量隨著時(shí)間變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9 416.097，P＜0.01），且從不同時(shí)間點(diǎn)上測(cè)得的含量因組間干預(yù)因素的不同而改變（F=77.748，P＜0.01），總體不同組別擬桿菌屬含量不同（F=52.765，P＜0.01）。見表6、圖2-2，B2、B3 組在第20 天予致病因子干預(yù)后，在造模第22 天擬桿菌屬含量升高達(dá)峰（P＜0.05），第25 天可回落至正常水平（與A1組相比P＞0.05）。

表5 不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠糞便樣品中大腸桿菌屬實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

圖2 各組小鼠糞便大腸桿菌屬、擬桿菌屬、腸球菌屬、梭菌屬含量變化

2.4.1.3 腸球菌屬

各組腸球菌屬的含量隨著時(shí)間變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8 491.909，P＜0.01），且從不同時(shí)間點(diǎn)上測(cè)得的含量隨著各組之間處理方式的改變而改變（F=13.06，P＜0.01），不同組別腸球菌屬含量總體而言不同（F=814.994，P＜0.01），B 組腸球菌屬含量高于 A 組（P＜0.05）。見表7，圖2-3，從造模第1天起，B組腸球菌屬含量逐漸增多（P＜0.05），在第20天予致病因子后，B2、B3組腸球菌屬含量均下降，第22天降至最低，第25天又出現(xiàn)一峰值，二者變化趨勢(shì)大致相同，B3組變化幅度更大。

2.4.1.4 梭菌屬

各組梭菌屬含量隨著時(shí)間變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3 747.116，P＜0.01），且從不同時(shí)間點(diǎn)上測(cè)得的含量隨著各組之間處理方式的改變而改變（F=6.752，P＜0.01），不同組別梭菌屬含量不全相同，總體B1 組梭菌屬含量最高（P＜0.05）。見表8、圖2-4，對(duì)比所測(cè)其他細(xì)菌，各組梭菌屬的含量變化相對(duì)較小，B1組在第25天建模成功后出現(xiàn)上升趨勢(shì)。

表6 不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠糞便樣品中擬桿菌屬實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

表7 不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠糞便樣品中腸球菌屬實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

表8 不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠糞便樣品中梭菌屬實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

2.4.2 各組內(nèi)不同細(xì)菌變化情況的比較

以小鼠糞便中所測(cè)各細(xì)菌造模前的基因含量為參照，將各細(xì)菌不同時(shí)間點(diǎn)的增長(zhǎng)倍數(shù)在各組中所占的百分比繪制成堆疊圖，可直觀地反映各組不同時(shí)間點(diǎn)不同細(xì)菌的變化情況（見圖3）。A1 組菌群雖有波動(dòng)，但各菌群增減總體保持穩(wěn)定。A2、A3 組在造模第20 天之前（包括第20 天）各菌群的變化也維持動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，給予相應(yīng)的致病因子后，A2 組在第21、22天，糞便中大腸桿菌屬異常增多，第25、30天菌群變化情況逐漸恢復(fù)正常；A3組第22天也以大腸桿菌屬異常增長(zhǎng)為主。B組從造模開始，腸球菌屬增長(zhǎng)即占優(yōu)勢(shì)。在沒(méi)有外源性ETEC 或LPS 感染的B1 組，腸內(nèi)條件致病菌變化情況以腸球菌屬異常增多為主；B2、B3組在第21、22天出現(xiàn)大腸桿菌屬、擬桿菌屬特異性增多。

2.5 結(jié)腸HE染色切片觀察

見圖4-1、圖4-2，A1 組結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞排列致密整齊，固有層中大腸腺密集，含有大量的杯狀細(xì)胞，黏膜下層結(jié)締組織無(wú)明顯病理性改變。與A1組相比，A2組結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞增生變形，其余組織形態(tài)未見明顯變化；A3 組腸黏膜上皮未見明顯改變，固有層中腺體萎縮、數(shù)量減少，固有層及黏膜下層結(jié)締組織疏松水腫。與A1組相比，B組總體腸內(nèi)皺襞減少。B1組腸上皮細(xì)胞無(wú)顯著改變，黏膜層與黏膜下層結(jié)締組織未見明顯疏松，固有層中可見淋巴小結(jié)及炎細(xì)胞浸潤(rùn)；B2組腸黏膜上皮細(xì)胞破碎缺損，固有層中可見淋巴小結(jié)及炎細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜下層結(jié)締組織疏松水腫明顯；B3組腸黏膜上皮見空泡樣變性，固有層與黏膜下層結(jié)締組織疏松，固有層中可見炎細(xì)胞浸潤(rùn)及淋巴濾泡形成。

2.6 結(jié)腸TNF-α、IL-6基因表達(dá)量

見表9、圖5，與A組及B1組相比，B2、B3組TNF-α水平升高（P＜0.01），B3 組TNF-α 水平高于 B2 組（P＜0.01）。與A1組相比，B2、B3組IL-6水平升高（P＜0.05），其余組間IL-6水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

圖3 各組小鼠糞便大腸桿菌屬、擬桿菌屬、腸球菌屬、梭菌屬比例變化

表9 各組小鼠結(jié)腸組織TNF-α、IL-6實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

圖4-1 各組小鼠結(jié)腸組織HE染色（×100）

圖4-2 各組小鼠結(jié)腸組織HE染色（×400）

圖5 各組小鼠結(jié)腸TNF-α、IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量

“證候”是中醫(yī)學(xué)獨(dú)特的存在根基。隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化的推進(jìn)，中醫(yī)證候動(dòng)物模型已成為中醫(yī)藥研究中不可或缺的一部分[10]，標(biāo)準(zhǔn)化的動(dòng)物模型的復(fù)制是研究證候?qū)嵸|(zhì)、促進(jìn)新藥開發(fā)及提高臨床治療效應(yīng)的關(guān)鍵。濕熱證動(dòng)物模型的研究始于20世紀(jì)80年代[11]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，本病癥為內(nèi)外合邪致病，薛生白[12]在《濕熱論》中明確指出其發(fā)病機(jī)制為“太陰內(nèi)傷，濕飲停聚，客邪再至，內(nèi)外相引，故病濕熱”。后世研究者多以此為理論基礎(chǔ)，不斷改進(jìn)造模方法，從使用單一因素造模[11]逐步發(fā)展為“環(huán)境+飲食+生物感染因素”的復(fù)合多因素造模方式[2,13-17]，從最初以細(xì)菌（大腸桿菌、傷寒桿菌）[11]為感染因素逐步發(fā)展到使用內(nèi)毒素[13]為致病因素，最后引入病毒[2,4,16-17]、LPS[5-6]進(jìn)行造模。盡管濕熱證動(dòng)物模型復(fù)合多因素造模的方式現(xiàn)已較為成熟，但縱觀該領(lǐng)域的研究，均通過(guò)對(duì)模型動(dòng)物的體溫、體重、飲食量、飲水量、舌象、癥狀表現(xiàn)等多種宏觀證候指標(biāo)進(jìn)行觀察、評(píng)判，以證實(shí)動(dòng)物模型證候模擬成功，但上述指標(biāo)主觀性均較強(qiáng)，尚缺乏統(tǒng)一的客觀化標(biāo)準(zhǔn)來(lái)評(píng)價(jià)模型建立的成功與否。本研究以此為切入點(diǎn)，使用ETEC 和LPS 模擬外來(lái)病邪，氣候箱模擬嶺南地區(qū)濕熱外環(huán)境，高脂高糖飲食模擬嶺南地區(qū)居民嗜好的煎炸、甜食、糯米等肥甘厚膩之品，肥甘飲食損傷脾胃，導(dǎo)致濕熱內(nèi)生而形成內(nèi)濕因素，并將以細(xì)菌和細(xì)菌內(nèi)毒素的主要活性物質(zhì)LPS為不同致病因素的兩種造模方式進(jìn)行對(duì)比觀察，以發(fā)掘具有證候模型評(píng)價(jià)潛力的客觀指標(biāo)。從發(fā)病角度來(lái)看，雖然兩種造模方式均為復(fù)合多因素造模，既考慮了內(nèi)濕因素，又考慮了外在因素（氣候環(huán)境及濕熱病邪），但以ETEC 經(jīng)口灌胃感染的模型小鼠似乎更加符合中醫(yī)濕熱病邪“從口鼻而入”[12]的發(fā)病機(jī)制。從癥狀表現(xiàn)來(lái)看，以LPS 為致病因子的模型小鼠精神差、納差、消瘦、聳毛等情況更為嚴(yán)重，而以ETEC 為生物致病因子的模型小鼠黏液便、便溏等癥狀更為明顯。但無(wú)論哪種造模方式，根據(jù)現(xiàn)有的模型評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，兩組模型小鼠（B2、B3 組）造模后均出現(xiàn)了糞便濕軟或黏液便、肛門紅腫充血等“濕熱”癥狀，二者癥狀積分總體無(wú)顯著差異，可認(rèn)為基本復(fù)制了嶺南濕熱證動(dòng)物模型。

隨著人們對(duì)腸道微生態(tài)認(rèn)識(shí)的不斷加深，腸道微生態(tài)與人類健康和疾病的關(guān)系已成為臨床醫(yī)學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)及中醫(yī)藥學(xué)研究領(lǐng)域的重點(diǎn)和熱點(diǎn)[18-19]。腸道菌群是腸道微生態(tài)的重要組成部分，在宿主免疫調(diào)節(jié)、營(yíng)養(yǎng)吸收、藥物代謝等眾多方面起重要作用[20-22]，在炎癥中亦扮演著重要角色[23]。眾多研究[2-6,16]認(rèn)為，濕熱證與炎癥密切相關(guān)。腸道菌群與免疫炎癥反應(yīng)的關(guān)系或許是研究其與濕熱證關(guān)系的重要橋梁。本實(shí)驗(yàn)中除A1 組外，結(jié)腸病理閱片及炎癥指標(biāo)TNF-α、IL-6的檢測(cè)結(jié)果亦支持炎癥的存在。結(jié)合腸道菌群及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的角度推測(cè)濕熱證發(fā)生炎癥的機(jī)制主要包括兩個(gè)方面：一方面，高脂高糖飲食及濕熱外環(huán)境引起腸道菌群失調(diào)，激活模式識(shí)別受體Toll 樣受體4（Tolllike receptor 4，TLR4），并使腸內(nèi)對(duì) LPS 有解毒作用的堿性磷酸酶釋放減少，導(dǎo)致緊密連接蛋白、黏液及抗菌肽生成減少，腸道黏液層厚度變薄，腸道完整性受破壞，腸道通透性增加，引起細(xì)菌移位及代謝性內(nèi)毒素血癥，從而誘發(fā)慢性低度炎癥[23-24]。另一方面，外源性大腸桿菌感染及LPS 的注射進(jìn)一步激活巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞的TLR4，啟動(dòng)炎癥信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過(guò)NF-κB 和MAPK 等信號(hào)通路促進(jìn)炎癥因子TNF-α、IL-6 等的表達(dá)釋放，最終導(dǎo)致炎癥發(fā)生[25-26]。從各組的炎癥表現(xiàn)來(lái)看，以LPS 為外來(lái)致病因素的小鼠較以ETEC 為生物致病因子炎癥反應(yīng)更重（A3 組炎癥反應(yīng)重于 A2 組，B3 組炎癥反應(yīng)重于 B2 組），“飲食+環(huán)境+ETEC/LPS”的復(fù)合多因素影響下的模型（B2、B3 組）炎癥因子水平高于單一致病因子（A2、A3組）或“飲食+環(huán)境”（B1 組）影響下的實(shí)驗(yàn)小鼠炎癥因子水平，提示嶺南濕熱證動(dòng)物模型復(fù)合多因素造模的必要性。

在炎癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，腸道菌群中的條件致病菌“功不可沒(méi)”。寄生在人體表或體腔的條件致病菌在正常機(jī)體中不會(huì)致病，在免疫功能不全或其他不健康的特殊條件下則有害[27]，其品種和數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于致病菌，因而更容易發(fā)生細(xì)菌移位，誘發(fā)免疫應(yīng)答，導(dǎo)致炎癥、內(nèi)源性感染、組織損傷，最終可能誘發(fā)敗血癥、多器官功能障礙綜合征，甚至死亡[28-31]。本實(shí)驗(yàn)選取大腸桿菌屬、擬桿菌屬、腸球菌屬和梭菌屬四種人和小鼠腸道內(nèi)最主要的條件致病菌進(jìn)行研究，由菌群檢測(cè)結(jié)果可知，在造模過(guò)程中，除A1組菌群變化相對(duì)穩(wěn)定之外，其余小鼠均出現(xiàn)了菌群重建，在給予不同的致病因子后所測(cè)腸道菌群變化尤為明顯，反映了腸道菌群與濕熱證密切相關(guān)，也表明外來(lái)致病因素在濕熱證發(fā)病過(guò)程中的重要參與作用。大腸桿菌屬、擬桿菌屬、腸球菌屬在兩組模型小鼠的菌群變化中趨勢(shì)較為一致，其中大腸桿菌屬、擬桿菌屬在建模成功之前提前出現(xiàn)特征性變化。

從大腸桿菌屬的變化來(lái)看，B2、B3 組小鼠在造模第21 天即明顯增多并達(dá)峰，至第25 天模型成立時(shí)雖已呈下降趨勢(shì)，但其含量仍高于自身造模前及同時(shí)期其他4 組的大腸桿菌量，這與王婷等[6]的研究結(jié)果一致。長(zhǎng)期高脂高糖飲食及外源性致病菌、LPS 的干擾使腸道處于炎癥環(huán)境，大腸桿菌作為一種兼性厭氧菌，在炎癥及腸屏障功能受損的情況下，可利用宿主免疫反應(yīng)產(chǎn)生的硝酸鹽作為能量來(lái)源，具有顯著的增長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)[32-33]，B3組表現(xiàn)最為明顯。A2組造模第22天大腸桿菌屬也增多，A2、B2 組小鼠糞便中大腸桿菌增多，不排除部分原因是小鼠腸內(nèi)原有菌群的定植抗力將灌胃感染的大腸桿菌從體內(nèi)排出（定植抗力即正常微生物群抵抗外來(lái)微生物群生長(zhǎng)和長(zhǎng)期存在的能力[34]）。B2組由于腸道長(zhǎng)期處于慢性炎癥狀態(tài)，使其本土菌群的定植抗力減輕[35]，故B2 組糞便中第21、22 天大腸桿菌屬的量遠(yuǎn)不及A2組，可認(rèn)為B2組排出的外源性致病性大腸桿菌量少于A2組，或者說(shuō)更多致病性大腸桿菌在B2 組小鼠體內(nèi)定居導(dǎo)致感染。研究[34,36-37]表明，高脂飲食引起腸道菌群改變，緊密連接蛋白表達(dá)減少，影響細(xì)胞旁通透性，導(dǎo)致腸屏障功能受損，因而增加感染的易感性。從定植抗力這個(gè)角度來(lái)講，炎癥狀態(tài)下腸道本土菌群定植抗性被破壞，促進(jìn)病原體生長(zhǎng)，導(dǎo)致反復(fù)感染、菌群紊亂，與濕熱證“纏綿難愈”的特性不謀而合，可能可將其視為病理機(jī)制之一。

擬桿菌屬是人和小鼠腸道中的正常菌群之一，其含量一般比較穩(wěn)定[38]，正常情況下在宿主的免疫、營(yíng)養(yǎng)代謝等方面起重要作用，但也是一種潛在的致病菌[39-40]。在造模第 20 天給予致病因子后，B2、B3 組擬桿菌屬均特異性增多，在模型成立之前率先提示模型小鼠的病理性狀態(tài)。A2、A3、B1 組擬桿菌屬變化均較為穩(wěn)定，并不同于B2、B3組，提示嶺南濕熱證模型并非外來(lái)致病因子與環(huán)境、飲食因素的簡(jiǎn)單相加，而是各因素綜合作用的結(jié)果，其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

腸球菌屬是人和動(dòng)物腸道內(nèi)一種重要的條件致病菌[41]，現(xiàn)已被認(rèn)為是腸易激綜合征的潛在生物標(biāo)志物之一[42]。腸球菌屬具有強(qiáng)抵抗力，本實(shí)驗(yàn)表明在高脂高糖飲食及濕熱環(huán)境影響下（B組）仍可增長(zhǎng)。腸球菌屬為革蘭氏陽(yáng)性菌，在給予B2、B3組致病因子后腸道處于炎癥高點(diǎn)的情況下，可能由于其表面的磷壁酸被機(jī)體免疫細(xì)胞識(shí)別導(dǎo)致一過(guò)性降低；而由于其基因組高度的可塑性，易發(fā)生突變，以及具備免疫逃逸、形成生物膜的能力，故腸球菌屬能在惡劣的環(huán)境下生存并促進(jìn)感染，加重炎癥[43]，表現(xiàn)為在模型成立時(shí)其含量顯著增多，這也與王婷等[6]的研究成果是一致的。本實(shí)驗(yàn)中B1組用“高脂高糖飲食+濕熱環(huán)境”影響實(shí)驗(yàn)小鼠，此實(shí)為郭氏所創(chuàng)“濕阻證”動(dòng)物模型的造模方法[44]。飲食不節(jié)，嗜食肥甘厚味，損傷脾胃，而脾主運(yùn)化，脾失健運(yùn)則痰濕內(nèi)生，加之潮濕溫暖的外環(huán)境，外濕侵襲，導(dǎo)致濕邪彌漫。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，B1組條件致病菌的變化均以腸球菌屬增長(zhǎng)為主，故腸球菌屬可能可視為“濕”的特征性菌屬。

對(duì)比其他菌屬，梭菌屬在嶺南濕熱證動(dòng)物模型的建模過(guò)程中變化較為穩(wěn)定，在B2、B3 組中無(wú)明顯特異性改變，而B1組后期梭菌屬相對(duì)含量出現(xiàn)增多。在實(shí)驗(yàn)后期，B 組小鼠逐漸出現(xiàn)耳紅、爪紅等“熱”象，其中以B1 組最為明顯。葉天士在《溫?zé)嵴摗穂45]中指出“然其化熱則一”，表明濕邪最終都可化燥生熱的轉(zhuǎn)歸。在謝婧[46]的研究中，濕熱證熱重于濕組小鼠模型糞便中亦出現(xiàn)梭菌含量增加，而濕重于熱組梭菌含量降低。這些均提示梭菌屬可能可視為“熱”的特征性菌屬。

綜上所述，無(wú)論從癥狀表現(xiàn)、菌群變化或中醫(yī)發(fā)病機(jī)理的角度看，單一的外來(lái)致病因素（細(xì)菌或內(nèi)毒素）或僅靠“飲食+環(huán)境”因素造模都不能復(fù)制出完整的嶺南濕熱證動(dòng)物模型。在復(fù)合多因素造模原則的指導(dǎo)下，使用ETEC 或LPS 作為外來(lái)致病因子均建模成功，這兩種模型小鼠在建模過(guò)程中腸道條件致病菌菌群發(fā)生變化，大腸桿菌屬、擬桿菌屬、腸球菌屬、梭菌屬的改變均反映了模型小鼠病理性狀態(tài)的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，這與小鼠的癥狀表現(xiàn)、結(jié)腸病理及炎癥因子的檢測(cè)結(jié)果是相一致的，表明特定腸道菌群在濕熱證客觀評(píng)價(jià)指標(biāo)的發(fā)掘上具有廣闊前景。其中，大腸桿菌屬、擬桿菌屬在建模成功之前均出現(xiàn)特征性的增多，或許二者可成為用于濕熱證早期診斷的客觀輔助指標(biāo)，而腸球菌屬和梭菌屬分別在證候“濕”、“熱”屬性的判斷上具有特殊意義。