基于網絡藥理學探討補陽還五湯治療高脂血癥的作用機制＊

姬夢姣，朱博冉，魏亞男，張文苑，翟 意，陶偉偉，吳顥昕

（南京中醫藥大學中醫學院·中西醫結合學院 中醫腦病重點實驗室 南京 210023）

高脂血癥（hyperlipidemia，HLP）主要是脂質代謝異常，其病理表現主要與血漿或血清中的總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白-膽固醇（LDL-C）、甘油三酯（TG）水平升高和（或）高密度蛋白-膽固醇（HDL-C）水平降低有關，可導致多種并發癥的產生，如動脈粥樣硬化、糖尿病、阿爾茲海默癥和帕金森病等[1-2]。中醫學高脂血癥與“肥胖”“中風”“血瘀”“痰濁”“血濁”等病類似，其發病因素涉及多種方面，飲食、情緒、勞倦均與之相關[3]；病機方面，高脂血癥為本虛標實之證，以正虛為本、痰瘀為標[4]。

中醫治療高脂血癥針對正虛、痰濕、瘀血主要以益氣活血化瘀中藥治療。補陽還五湯（Buyang Huanwu decoction）出自清代醫家王清仁《醫林改錯》，是益氣活血的代表方，由7味中藥（黃芪、赤芍、歸尾、川芎、地龍、桃仁和紅花）組成，本方以補氣為主，活血祛瘀為輔，共奏補氣活血化瘀之功效，主要用于氣虛血瘀之癥[5]。現代研究表明，補陽還五湯具有降脂降糖、抗炎、抗缺氧、降壓、改善微循環以及抗血栓等作用，對治療高脂血癥、心血管疾病和糖尿病腎病等療效較佳[6-8]。臨床及實驗研究表明，補陽還五湯可顯著改善高脂血癥[9-12]。

由于中藥復方成分的復雜性和靶點的不確定性，常規藥理研究方法難以全面闡明補陽還五湯治療高脂血癥的分子作用機制。因此，本研究借助網絡藥理學從系統性，從整體角度來探究補陽還五湯治療高脂血癥的作用機制，以期提供新的思路。

1 方法

1.1 補陽還五湯化學成分的獲取與篩選及靶點預測

利用TCMSP 數據庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）對補陽還五湯成分數據庫進行構建，并對主要活性成分進行篩選。根據TCMSP 數據庫使用指南，將OB 值（生物利用度）的標準設定為≥30%，DL 值（類藥性）≥0.18。因為TCMSP 數據庫中未收錄“當歸尾”“地龍”相關數據，所以根據2015年版《中華人民共和國藥典》一部規范藥材名，將當歸代替當歸尾處理，并從TCMID 數據庫（http://www.megabionet.org/tcmid/）中獲取“地龍”的化學成分。利用STICH 數據庫（http://stich.embl.de/）將以上獲得的潛在成分進行靶點預測并利用UniProt KB 數據庫(http://www.uniprot.org)對以上獲得的藥物成分靶點進行規范命名。

1.2 高脂血癥疾病靶點獲取

通過人類表型數據庫HPO（https://hpo.jax.org/）檢索高脂血癥相關基因，并與成分靶點合并進行下一步網絡構建和分析。

1.3 網絡構建和分析

將以上獲得的成分靶點和疾病靶點導入至STRING 數據庫（https://string-db.org/）中，得到成分靶點和疾病靶點的拓撲網絡關系，利用Cytoscape 3.6.1軟件建立可視化網絡拓撲圖，了解蛋白與蛋白之間的聯系。在構建補陽還五湯所含藥物的靶點與高脂血癥基因相互作用網絡的核心節點(hubs)網絡的基礎上，以“節點連接度（degree）”“節點緊密度(closeness)”“節點介度(betweenness)”的中位數為卡值，選取同時滿足三個卡值的節點作為補陽還五湯防治高脂血癥失衡網絡的候選靶點。本研究通過對上述藥物候選靶點所參與的通路進行富集分析，進一步挖掘補陽還五湯防治高脂血癥的關鍵病理環節分子機制，并構建“補陽還五湯-化學成分-核心靶點-關鍵通路”的多層次網絡關聯圖。

1.4 KEGG通路分析

本研究采用DAVID 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp）對候選靶點進行通路富集分析以闡明候選靶點蛋白在信號通路中的作用，并根據通路富集結果獲得相應的P值，選擇P＜0.01 的排序前20 的通路，然后再利用R 語言將獲得的KEGG 通路制作成氣泡圖。

2 結果

2.1 化學成分篩選與靶點預測

根據TCMSP 數據庫收集補陽還五湯的化學成分，分別獲得各單味藥中的潛在活性成分，黃芪20 個，當歸2個，赤芍29個，川芎7個，桃仁23個，紅花15個，從TCMID數據庫中獲得地龍的潛在活性成分7個。有些化合物，如黃芪甲苷（黃芪）、阿魏酸（當歸）、藁本內酯（當歸）、苦杏仁苷（桃仁）、紅花黃色素（紅花）、亞油酸（當歸）不符合篩選條件，但是根據2015 年版《中華人民共和國藥典》得知以上大多數成分屬于各中藥的指標性成分，且阿魏酸和藁本內酯為當歸與川芎所共有，亞油酸為當歸、川芎、桃仁和紅花所共有，結合文獻搜索也發現這些成分對于高脂血癥有相關治療作用[13-14]，故將這6 個成分補充到成分篩選中，因此共得107 個潛在活性成分。通過查找文獻補充疾病相關化合物的方法參考了劉楠等[15]的網絡藥理學的研究方法。通過常規方法再加上手動查找2015年版《中華人民共和國藥典》以及文獻，能更加全面的反應補陽還五湯化學成分防治高脂血癥的機制。

將以上獲得的107個潛在成分導入STICH 數據庫進行靶點預測，去除無靶點者共獲得801個靶點，其中黃芪 202 個，當歸 85 個，赤芍 138 個，川芎 112 個，桃仁67 個，紅花 138 個，地龍 59 個，具體信息見表 1。將以上獲得的補陽還五湯的潛在活性成分去掉重復成分后得到潛在活性成分共計100 個。有重復成分者如β-谷甾醇，阿魏酸，亞油酸等，將其按順序劃歸到最開始出現的中藥上，如β-谷甾醇劃歸為黃芪。故最終刪除重復成分的靶點后共獲得487 個靶點，用于下一步研究。

2.2 疾病靶點獲取

將高脂血癥（Hypwelipidemia）為關鍵詞輸入到人類表型數據庫HPO 中，設置搜索條件為HPO brower，選擇相關基因（associated genes）條目，得到關于高脂血癥的疾病靶點95個，并將其與成分靶點合并以進行下一步網絡構建與分析。

2.3 靶點網絡構建

將成分靶點和疾病靶點合并導入至STRING 數據庫中，其中settings 項目下的minimum required interaction score 選擇 highest confidence(0.900)，得到成分靶點和疾病靶點的拓撲網絡關系，再利用Cytoscape 3.6.1 軟件建立可視化網絡拓撲圖，得到圖1A，然后根據“degree”“closeness”和“betweenness”條件篩選得到圖1B（圖中黃色部分為符合條件者），將符合條件的靶點篩選出得到圖1C。圖1 是篩選補陽還五湯治療高脂血癥核心靶點的整個過程。

表1 “中藥-成分-靶點”基本信息

結果顯示，核心靶點113個，其中治療高脂血癥的直接靶點19 個，潛在靶點94 個，篩選出的這些靶點組成補陽還五湯治療高脂血癥的潛在靶點網絡，將核心靶點整理得到圖2。如圖所示，節點的大小代表degree值的大小，degree值越大，說明這個節點在網絡中的作用越大。113個核心靶點中degree排序前20的靶點分別是CREB 結合蛋白（CREBBP）、細胞腫瘤抗原p53（TP53）、維甲酸受體RXR-alpha（RXRA）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、信號傳導及轉錄激活因子3（STAT3）、轉錄因子 AP-1（JUN）、轉錄因 子 p65（RELA）、腫瘤壞死因子-α（TNF）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、RNA聚合酶II轉錄亞基1 的介體（MED1）、白介素-6（IL6）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARA）、白介素8（CXCL8）、載脂蛋白AI（APOA1）、核因子NF-κB p105亞基（NFKB1）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶SRC（SRC）、肝型脂肪酸結合蛋白（FABP1）、載脂蛋白B（APOB）、胰島素（INS）。見表2。

圖1 網絡拓撲分析

圖2 補陽還五湯靶點-疾病靶點相互作用靶點網絡

表2 degree值排名前20靶點

2.4 補陽還五湯治療高脂血癥的通路篩選

利用DAVID 數據庫對以上篩選出的113 個核心靶點進行KEGG 通路富集，共獲得126 條通路，其中P＜0.05 的前 20 條通路通過 R 語言（R3.6.1，繪圖包ggplot2）進行可視化處理，見圖3。其中氣泡面積大小代表基因數量，氣泡顏色代表P值的大小，即富集顯著性。篩選出的這20 條通路中與疾病相關通路有11條，分別是乙肝，癌癥通路，胰腺癌，癌癥中的蛋白多糖，前列腺癌，弓形體病，膀胱癌，丙肝，非小細胞肺癌，小細胞肺癌，恰加斯病；另外9 條通路與代謝、炎癥、缺氧及其他方面相關，分別是HIF-1 信號通路，TNF 信號通路，脂肪細胞因子信號通路，PI3K-Akt 信號通路，FoxO 信號通路，甲狀腺激素信號通路，反轉錄內源性大麻素信號，催乳素信號通路，γ-氨基丁酸能突觸。

2.5 補陽還五湯防治高脂血癥的“中藥-成分-靶點-通路”的多層次網絡關聯圖

整合以上綜合數據，利用Cytoscape 3.6.1 軟件進一步構建“補陽還五湯-化學成分-核心靶點-關鍵通路”的多層次網絡圖，見圖4。本研究結果顯示，補陽還五湯治療高脂血癥的作用主要與22 個化學成分以及作用于20 條主要作用通路的113 個核心靶點相關聯，這是該方發揮治療高脂血癥藥效的核心所在，也體現了多成分與多靶點之間共同作用的機制，符合中藥復方作用的特點。

圖3 補陽還五湯核心靶點參與的通路信息

3 分析與展望

3.1 補陽還五湯成分分析

通過“補陽還五湯-化學成分-核心靶點-關鍵通路”的多層次網絡關聯圖可知，補陽還五湯治療高脂血癥的有效成分有22個，其中有較多作用靶點的成分主要有亞油酸（24）、黃芩素（22）、槲皮素（21）和山奈酚（17）。Bruen等[16]研究證明，亞油酸可抗動脈粥樣硬化，主要通過抑制炎癥反應、抑制泡沫細胞形成和調節循環膽固醇來發揮作用。黃芩素主要發揮抗氧化和抗炎活性，清除活性氧，并通過減弱NF-κB 的活性抑制多種炎性細胞因子和趨化因子，可用于治療糖尿病，心血管疾病，炎性腸病等[17]。山奈酚和槲皮素有降糖降脂、抗炎、抗氧化、抗癌等作用[18]，山奈酚可以通過增加肝臟 PPARα 水平，下調 SREBPs 并促進 ACO 和CYP4A1 的肝表達來增加脂質代謝，從而減少高脂飲食喂養的肥胖大鼠內臟脂肪的積累并改善高脂血癥[19]。槲皮素通過上調相關蛋白的表達水平（例如ABCA1 和ABCG1）以及通過減少氧化來提高HDL 和APOA1的膽固醇接受能力來改善膽固醇逆轉運，從而減少脂質積累[20]。上述研究表明，大多數主要成分都有抗炎，抗氧化，降糖降脂的作用，說明補陽還五湯是多種中藥協同作用，共奏益氣活血化瘀之功效，協同起效治療高脂血癥。

圖4 “補陽還五湯-化學成分-核心靶點-關鍵通路”多層次網絡圖

3.2 關鍵靶點分析

關鍵靶點的分析主要針對以上篩選出來degree值排名前20的靶點。通過分析，可以發現關鍵靶點主要涉及轉錄因子，脂質代謝相關因子和炎癥因子等。其中CREBBP和TP53是degree值最大的兩個靶點。

CREBBP，亦稱為CBP，是一種乙酰基轉移酶，由于在其與p300之間觀察到很高的序列同源性，所以現在將這兩種蛋白統稱為p300/CBP[21]。甾醇調節元件結合轉錄因子1（SREBP1C）是一種重要的脂肪生成活化劑，研究發現，在高葡萄糖和胰島素條件下，SREBP1C 在細胞和小鼠肝臟中均被p300/CBP 乙酰基轉移酶乙酰化，從而提高了其穩定性，并向其脂肪形成靶基因啟動子募集[22]。碳水化合物反應性元素結合蛋白（ChREBP）也被認為是脂肪生成的主要調節劑，與SREBP1C 協同作用以激活脂肪酸合成，研究發現p300/CBP 將 ChREBP 在 Lys-672 處乙酰化，從而通過增加其在培養的小鼠肝細胞中靶基因啟動子的募集來增強其轉錄活性[23]。因此，p300/CBP 可能通過SCREBP1C 和ChREBP 的乙酰化作用來調節脂質的合成，所以p300/CBP可作為高脂血癥的脂肪代謝途徑的重要防治因子。

TP53 是一種抑癌基因，也稱P53，可參與脂質代謝，葡萄糖代謝，核苷酸代謝等多種代謝途徑[24]。Vig等[25]研究表明p53 直接結合于SREBP-1 的啟動子區域，并在轉錄上抑制SREBP-1 的表達，從而抑制脂肪酸的合成。p53 轉錄誘導磷脂酰磷脂酶Lipin1，肉堿棕櫚酰轉移酶CPT1C 和丙二酰輔酶A 脫羧酶（MCD），從而促進脂肪酸氧化并阻止脂質在細胞中的蓄積[26-28]。

另外，PPARA 也是重要潛在靶點之一，與脂質代謝密切相關。PPARα 可調節體內葡萄糖和脂質代謝的平衡，在2型糖尿病中有重要作用[29]，PPARα 對脂肪酸的代謝有一定調節作用，主要通過調節過氧化物酶、脂肪酸運輸和線粒體脂肪酸β 氧化代謝基因轉錄與表達，但是此作用必須通過PPARα 激動劑激活[30]。PPARα 的激動劑有很多，其中包括貝特類藥物，通過激活脂質分解代謝，貝特類藥物持續降低患者的血漿甘油三酯，還能通過載脂蛋白A-I 和載脂蛋白A-II 提高人類血漿HDL，可用于治療血脂異常[31]。Tordjman K等[32]研究發現PPARα對高脂血癥的并發癥動脈粥樣硬化也有有益作用，PPAR-α 缺乏會改善ApoE 基因敲除小鼠的胰島素抵抗，并減少動脈粥樣硬化病變區域。常庚等[33]研究發現，補陽還五湯可明顯升高2 型糖尿病大鼠模型PPARα/γ mRNA 表達以及降低糖代謝參數水平及血脂水平，提示補陽還五湯可能通過調節PPARα/γ mRNA 的表達以達到改善胰島素抵抗和降血脂的作用。

以上研究說明，靶點 CREBBP、TP53 和 PPARA 有調節脂質代謝，糖代謝等作用，對于高脂血癥的防治有重要意義，同時，對其并發癥動脈粥樣硬化和糖尿病也有一定的作用。

3.3 通路結果分析

目前，有研究認為，高脂血癥主要涉及脂質代謝紊亂和炎癥，與胰島素抵抗密切相關。本研究結果顯示，KEGG 富集通路中，脂肪細胞因子信號通路與肥胖、胰島素抵抗、高血壓和血脂異常等疾病密切相關，脂肪細胞因子包括脂類（瘦素、抵抗素、脂聯素和內脂素）和經典細胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6 等），通過調節血管功能、免疫和脂肪細胞代謝成為代謝綜合征發病機制的關鍵參與者[34]。多數研究證明，補陽還五湯可降低TNF，IL-6 等相關因子的表達[35-36]。高脂血癥的發生，發展以及并發癥常伴有炎癥[37]和內皮功能障礙[38]，炎癥組織的特征在于低氧狀況和免疫細胞浸潤，TNF 信號通路和HIF-1 信號通路主要涉及炎癥反應和缺氧[39]。Mylonis 等[40]研究發現，在缺氧條件下，HIF 對維持細胞代謝平衡起重要作用，因為HIF可以上調糖酵解通路以及降低線粒體功能，同時缺氧也可以增強脂肪生成，主要是因為涉及脂肪酸（FA）攝取，合成和儲存的基因由HIF 依賴性誘導，所以HIF 參與糖代謝與脂質代謝的調節。其他重要通路還包括PI3K-Akt 信號通路和FoxO 信號通路，二者功能密不可分，其中PI3K-Akt 信號通路作用廣泛，可調節葡萄糖穩態，脂質代謝，蛋白質合成等[41]，FoxO 信號通路中FoxO 亞家族介導胰島素或類胰島素生長因子對涉及細胞代謝，生長，分化，氧化應激，衰老，自噬和衰老的關鍵功能起到抑制作用[42]，FoxO1 可被PI3K-Akt 磷酸化所調節，所以PI3K/Akt 可通過FoxO1和GSK-3 調節葡萄糖代謝，通過mTORC1 和SREBP調節脂質代謝[43]。上述研究表明，PI3K/Akt 與FoxO信號通路協同作用于糖脂代謝。Dae Hyun Kim 等[44]研究表明在高齡大鼠中，FoxO1 活性降低會導致高脂血癥和 PPARγ 升高，FoxO1 與 PPARγ 的相互作用可促進肝脂肪變性，這是由于高血糖誘導的內質網應激，從而導致Akt 信號傳導受損，例如與衰老相關的糖尿病。此外，有研究表明，p300/CBP 組蛋白乙酰轉移酶活性的抑制作用顯著降低了空腹小鼠肝臟中FoxO1 的mRNA 和蛋白水平以及空腹血糖水平[45]。通過以上預測通路發現，補陽還五湯治療高脂血癥主要集中于脂質代謝、缺氧與炎癥通路，這對以后的研究是一個提示。

3.4 展望

本研究表明補陽還五湯可能通過作用于CREBBP、TP53、PPARA、TNF、IL6 等多個靶點，調節脂肪細胞因子、TNF、HIF-1、PI3K-Akt 和 FoxO 等信號通路，通過調節脂質代謝，炎癥反應，缺氧，改善胰島素抵抗等機制治療高脂血癥。另外，補陽還五湯治療高脂血癥與高血糖密切相關，高血糖與高血脂緊密相關，其發病機制分別涉及糖代謝與脂質代謝，糖脂代謝互相關聯且補陽還五湯可能同時作用于兩者發揮降糖降脂的作用，本研究提示補陽還五湯可能調節代謝用于高脂血癥或高脂血癥伴有高血糖的治療。該研究為深入探討補陽還五湯對高脂血癥的作用機制提供了指導。由于本實驗研究是基于生物信息學及大量數據庫的計算得出的結果，后續還需要進一步的體內外研究進行驗證。