基于文獻計量學和系統藥理學方法探究半夏瀉心湯對慢性胃炎的作用＊

楊文娜，鄭景輝，徐文華

（廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院 南寧 530000）

慢性胃炎（chronic gastritis，CG）是人類最常見的消化系統疾病之一，臨床發病率高，據估計，目前全球范圍內有超過一半的人患有慢性胃炎[1]。胃炎中的終身炎癥和侵襲性炎癥可隨著時間（數年或數十年）的推移引起胃粘膜的破壞，導致發生萎縮性胃炎、消化性潰瘍或胃癌，具有嚴重的致死后遺癥。慢性胃炎的臨床表現以惡心、胃脹胃痛、呃逆、食欲不振、噯氣等為主，其病程長且易反復發作。目前，西醫主要采取根除幽門螺桿菌、抑酸、保護胃黏膜、助消化、抗抑郁等藥物來治療本病[2]，臨床上收到一定效果，但患者長期服用易產生不良反應，且依從性較差。隨著疾病治療模式的轉變，人們越來越意識到中醫藥（補充與替代療法）在治療消化系統疾病中的作用，Dossett 等[3]一項34525 例胃腸道疾病人群調查研究研究顯示，在美國約有42%的人使用補充替代療法，其中排第一位就是植物藥治療，而且80%的人從中獲益。

中醫藥對慢性胃炎的病因病機、辨證分型、治療方法等有較完善的理論，治療慢性胃炎優勢明顯，能顯著改善患者臨床癥狀，提高生活質量。本研究通過文獻計量學方法，從中國知網和萬方數據庫上查找用于治療慢性胃炎的中醫藥，并對該主題的變化規律和定理進行客觀分析，從大框架層面粗略篩選出目前治療慢性胃炎較廣泛的中藥材或中醫方劑，挖掘其內在的規律和特點，基于此探討其特征和規律，以為臨床上的應用提供理論依據。此外，中醫藥成分繁多冗雜，傳統的藥理學研究方法尚不能全面的概括其作用機制，而系統藥理學是一門新興學科，是從分子、網絡、細胞到組織、器官等不同水平上研究藥物治療疾病能變化機制，建立藥物對于機體的作用從微觀（分子、生化網絡水平）到宏觀（組織、器官、整體水平）的各水平間是相互關聯的學問，其系統性、整體性的特點與中醫藥整體觀和辯證論治的原則相符合，為藥物復雜作用的研究提供了新思路、新方法和新技術[4]，故本研究運用系統藥理學方法來系統分析其作用機理，以期為推廣中醫藥的運用及基礎研究提供研究基礎和新思路。

1 材料與方法

1.1 檢索范圍與檢索策略

從數據庫檢索與慢性胃炎相關的文獻。文獻來源于中國期刊全文數據庫（CNKI）和萬方數據庫，檢索時間為數據庫建庫至今，采用主題詞加自由詞檢索，以“胃炎”“中藥”為主題詞；以“慢性胃炎”“胃炎”“胃竇炎”“胃脘痛”“胃痛”“痞滿”為篇名，各詞以“或”相連；篇名和主題詞以“且”相連進行檢索，文獻納入標準為已正式發表的期刊論文和學位論文。

1.2 提取文獻關鍵詞并繪制相關的高頻關鍵詞共現圖

從中國知網和萬方數據庫下載檢索出來的所有文獻，采用應用書目共現分析系統軟件-BICOMB 提取檢索文獻關鍵詞，選取出現頻次≥10 以上的關鍵詞作為高頻關鍵詞，并對高頻關鍵詞進行共現分析。再從高頻關鍵詞里篩選出與慢性胃炎相關的疾病（慢性萎縮性胃炎、慢性胃炎、胃痛、淺表性胃炎等）和與中醫藥（中藥復方、中藥和中成藥）的共現關系，借助Cytoscape 3.6.1 軟件分析慢性胃炎疾病與中醫藥的相關性，得到相關度最大的中藥或復方。

1.3 高頻方藥的有效化學成分篩選以及靶點的預測

從TCMSP 數據庫（http://lsp.nwu.edu.cn/）檢索1.2分析得到的高頻藥物所含有的化學成分，根據藥物ADME 性質以建議藥物篩選標準：口服生物利用度(Oralbioavailability，OB)≥30%、類藥性(Drug-likeness，DL)≥0.18[5-6]為選擇條件篩選出有效活性成分。TCMSP數據庫提供的活性成分的作用靶點是采用HIT數據庫中包含的實驗已驗證的藥物-靶點組合，而沒有實驗數據支持的藥物-靶點組合采用SysDT 和WES 模型預測來獲得藥物靶點之間的關系，本研究根據TCMSP 提供的化合物靶點取前10 個代表性靶點，錄入UniProt數據庫（https://www.uniprot.org/）和 STRING 數據庫（https://string-db.org/）中重新檢索取一致性靶點，去除非人源靶點，并轉化為Gene Symbol，收集整合得到有效化合物的作用靶點。

1.4 與慢性胃炎發病機制相關的靶點的遴選

從 TTD(https://db. idrblab. org/ttd/)、CTD（http://ctdbase. org/） 、 DiGSeE （http://210.107.182.61/geneSearch/）、OMIM（https://www.omim.org/)和Genecards（https://www.genecards.org/）數據庫里檢索與慢性胃炎相關的靶基因，將搜索到的靶點進行整合，去除重復靶點。將慢性胃炎相關的靶基因與化合物的作用靶點錄入venny 2.1分析服務器，得到二者重疊部分的靶點，認為重疊部分的靶點是高頻方藥對慢性胃炎的潛在作用靶點,收集重疊靶點進行進一步的網絡構建和分析。

1.5 高頻方藥對慢性胃炎的潛在作用靶點的生物信息學分析

利用STRING 數據庫觀察潛在治療靶點的相互作用關系，為了提高所獲得數據的可靠性，將PPI（protein protein interaction network，PPI network）作進一步篩選，最小交互分數取0.70（高置信度），得到關鍵作用靶點和蛋白互作網絡圖。采用Cytoscape 軟件對PPI 進行可視化分析，并借助軟件的Network Analyzer 計算平均最短路徑（ASPL）、中心度（BC）和度值（Degree）等參數。并依托Cytosacpe 的ClueGO 插件對關鍵作用靶點進行GO分析和KEGG分析。

1.6 有效化合物與關鍵作用靶點分子對接

為明確有效化合物被攝入機體后，能否與預測的作用靶點穩定結合進而發揮作用，本研究采取分子對接驗證預測的作用靶點與化合物的結合性。從PDB（http://www.rcsb.org/pdb/）數據庫中找到1.5 得到的關鍵靶蛋白的PDBID，從TCMSP 數據庫下載對應化合物信息，保存為mol2 格式，然后利用IGEMDOCK 軟件進行分子對接，得到分子對接得分數據。

2 結果

2.1 文獻檢索結果及共現分析

根據檢索策略在中國知網、萬方數據庫檢索相關文獻，中國知網上檢索到2207 篇相關文獻，萬方數據庫檢索到5388篇相關文獻，下載相關信息后利用書目共現分析系統軟件（BICOMB）對兩個數據庫文獻信息進行分析。中國知網2207篇相關文獻共提取到11563個關鍵詞，以頻次≥10以上的關鍵詞作為高頻關鍵詞，統計到有169 個高頻關鍵詞，從高頻關鍵詞中手動統計出與中醫藥相關的復方、單味中藥和中成藥有12項，出現頻數及所占比例見表1；萬方數據庫5388篇相關文獻提取到21179個關鍵詞，其中高頻關鍵詞有258項，統計出與中醫藥相關的復方、單味中藥和中成藥有18 項，詳細信息見表1。設定頻次閾值≥10 從BICOMB 里提取共現矩陣，手動剔除非相關關鍵詞如療效、中醫藥療法、臨床觀察、穴位貼敷等，把整理后的中醫藥(復方、單味中藥和中成藥)和慢性胃炎（胃炎、胃痛、胃竇炎、痞滿、淺表性胃炎等）的共現數據導入Cytoscape 軟件進行可視化分析，見圖2、圖3，網絡圖中節點表示中醫藥和慢性胃炎疾病，藥與病同時出現的頻次用兩者連線的粗細來體現，連線越粗，共現頻次越大。結果表明，半夏瀉心湯在慢性胃炎疾病中相關性是最大的，說明半夏瀉心湯是中醫藥在慢性胃炎疾病的應用中較廣泛的復方。

2.2 半夏瀉心湯的有效化學成分及靶點的收集和慢性胃炎相關發病靶點的搜集

在TCMSP 數據庫共收集到125 個（去除重復化合物后）有效化學成分，其中半夏13 個，黃芩36 個，黃連14 個，人參 22 個，大棗 29 個，干姜 5 個，甘草 23 個（OB≥60%、DL≥0.18），包括黃芩素、黃芩苷、小檗堿、黃連堿、人參皂苷RH2、甘草苷、槲皮素、山奈酚等；對應81個作用靶點，包括MMP1(基質金屬蛋白酶1)、CASP（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶）、PTGS（前列腺素內過氧化物酶）、SOD1(超氧化物歧化酶1)、NOS2（一氧化氮合酶2）等，半夏瀉心湯的藥物-化合物-靶點網狀關系圖見圖3。

2.3 半夏瀉心湯潛在作用靶點的PPI 和拓撲屬性分析

從 TTD 數據庫、CTD 數據庫、DiGSeE 數據庫、OMIM 數據庫和Genecards 數據庫里檢索與慢性胃炎相關的靶基因，其中CTD 數據庫和Genecards 數據庫根據系統相關性評分各取前300 個靶點，合并所收集到的靶點并去重后獲得497個靶點，經過VENNY 在線分析服務器對疾病靶點和化合物靶點進行交集得到29個重疊靶點，故這29個重疊靶點是半夏瀉心湯治療慢性胃炎的潛在作用靶點。

將29 個潛在作用靶點輸入STRING 數據庫，選擇人為研究機體，并設置為0.7 的高置信度交互分數，得到26 個靶蛋白相互作用信息數據，通過Cytoscape 軟件進行可視化分析，PPI 見圖4。經過拓撲分析，結果發現AKT1（蛋白激酶）為關鍵作用靶點，具有最大的度值（Degree）、中心性（Betweenness Centrality）和平均最短路徑（Average Shortest Path Length）。

表1 中醫藥（中藥、復方、中成藥）的出現頻次和百分比表

圖1 萬方數據庫中中醫藥（中藥、復方、中成藥）與慢性胃炎疾病（慢性胃炎、胃痛、胃竇炎、痞滿等）的相關性圖

圖2 中國知網數據庫中中醫藥（中藥、復方、中成藥）與慢性胃炎疾病（慢性胃炎、胃痛、胃竇炎、痞滿等）的相關性圖

2.4 半夏瀉心湯潛在作用靶點的生物信息學分析

圖3 半夏瀉心湯藥物-化合物-靶點關系圖

圖4 半夏瀉心湯潛在作用靶點PPI網絡

利用Cytoscape 軟件的插件-ClueGO 對半夏瀉心湯的關鍵作用靶點參與的生物學過程和信號通路進行分析。經過Bonferroni 校正P＜0.01，得到50 種生物學過程，大致聚類為9 個方面的：對機械刺激的反應、對細胞凋亡的調控、對干擾素-γ 的反應、對脂質定位的負調節、調節白細胞介素-12的產生、調控不飽和脂肪酸和前列腺素代謝過程、調節平滑肌細胞增殖、對神經遞質和活性氧代謝過程、氧化還原酶活性等的調節，見圖5。26個靶點富集出50條信號通路（校正P＜0.05），包括：NF-κB 信號通路、HIF-1 信號通路、VEGF信號通路、IL-17信號通路等，詳見圖6。

2.5 分子對接結果分析

分子對接是依據“鎖-鑰原理”，將化合物分子放入受體蛋白配體結合位點,依據讓兩者在幾何、能量上匹配的原則而相互識別，通過計算作用力進而預測兩者間的結合模式和親和力，從而進行藥物的虛擬篩選[7]，本研究借助分子對接技術幫助預測藥物對特定靶標的親和力及結合特性。IGEMDOCK 是款開源性的分子對接軟件,一般用于活性篩選和快速對接，對接準確度較高，IGEMDOCK 提供交互式界面，以制備靶蛋白的結合位點和篩選復合物庫，庫中的每個化合物都被固定到存儲箱中[8]。將受體蛋白和化合物分子信息輸入軟件后，群體大小（population size）設為200，子代（generations）設為 70，解決方案個數（number of solutions）設為2，得到分子對接結果，在構象搜索過程中，IGEMDock 采用的是經驗打分函數，經驗評分函數估計使用“結合能=范德華力+氫鍵”[9]，能量越低，化合物分子與受體結合的作用可能性越大，結合更穩定。對接結果見表2,由表中可知結合能范圍在-128.23 kcal/mol 至-70.97 kcal/mol 之間，靶點結合能平均值在-100 kcal/mol 以上，藥物對特定靶標的親和力及結合特性良好，其中結合性最好的是SOD1。

3 討論

圖5 半夏瀉心湯的關鍵作用靶點參與的生物學過程

圖6 半夏瀉心湯的關鍵作用靶點富集的信號通路

慢性胃炎屬于中醫的“痞滿”“嘈雜”“胃痛”等范疇，其病因病機主要是飲食不節、久病多瘀、情志內傷，導致濕熱中阻或寒邪凝滯、胃絡不通郁而發病[10]。中醫藥治療慢性胃炎有數千年的歷史,且具有獨特的優勢和廣闊的應用前景。半夏瀉心湯出自東漢時期張仲景的《傷寒雜病論》，方由半夏、黃芩、黃連、人參、大棗、干姜和甘草七種草本植物組成，具有調和肝脾，消痞散結之功效，是治療中焦疾病的代表方劑之一。本方臨床應用廣泛，凡屬寒熱錯雜之痞證、心下痞但滿而不痛，或嘔而腸鳴下利，中焦氣機不轉或氣機升降失調者，可用此方臨證加減治療。其應用主要集中于消化系統疾病領域，臨床常用于治療功能性消化不良[11]、結腸炎[12]、食管炎[13]、胃炎[14]等，以及其他方面的疾病如糖尿病、糖尿病胃輕癱、慢性肝炎等用此方也有良好的效果，例如趙昱等[15]臨床研究上發現，辛開苦降法（以半夏瀉心湯基本方加減）治療肥胖2型糖尿病安全有效，減肥降脂療效明顯優于對照組滋陰清熱組；周燕燕等[16]對比觀察半夏瀉心湯治療與常規西藥治療糖尿病胃輕癱患者，實驗表明，半夏瀉心湯治療糖尿病胃輕癱療效確切，有利于減輕臨床癥狀，縮短胃排空時間，觀察組患者的血清胃泌素指標GAS和SS含量均明顯優于治療前和對照組，差異有統計學意義。

本研究利用文獻計量學方法統計出中醫藥與慢性胃炎相關疾病的頻次和相關性，得出半夏瀉心湯是中醫治療慢性胃炎運用較廣泛的方藥。現代臨床和藥理研究證明半夏瀉心湯具有保護消化道黏膜、抗炎殺菌、抗氧化應激、雙向調節胃腸功能、調節腸道菌群等作用[17]。雖然半夏瀉心湯有一些有效化合物和作用靶點、路徑被探索過，但還有很多復雜的生物學機制仍未被揭曉，本研究利用系統藥理學方法系統性探討半夏瀉心湯對慢性胃炎的作用機理。

根據分子生物學特性，以類藥性和口服利用度對半夏瀉心湯所含有的化學成分進行初步篩選，得到125 個能進入機體的化學成分，包括槲皮素、黃芩素、人參皂苷、黃芩苷、小檗堿、甘草苷等，其中很多化學成分已有臨床和藥理試驗證實其有效性，如人參皂苷是人參起主要藥理作用的成分，具有抗炎、抗腫瘤作用的活性成分[18]，能通過抗氧化作用和調控與炎癥相關的信號通路來干預炎癥性細胞因子的產生；黃芩苷[19]和槲皮素[20]能抗炎、抗病毒、抗癌；甘草苷有抗潰瘍、抗心律失常、抗腫瘤等藥理作用，可用于治療或預防心律失常、心肌缺血、胃潰瘍、腫瘤等疾病。小檗堿具有抗菌、抗腫瘤和抗糖尿病的作用，LIN 等[21]研究報道，小檗堿能抑制或消除胃粘膜幽門螺桿菌感染，因此，可用于治療幽門螺桿菌引起的慢性胃炎，WU 等[22]證明，小檗堿能通過減弱B細胞激活因子（BAFF）觸發的Th17細胞因子反應，對幽門螺桿菌誘導的慢性胃炎產生抗炎作用。綜上推測：半夏瀉心湯是通過這些組分的協同作用，發揮抗炎、抗氧化、抗病毒等作用干預慢性胃炎的發生發展。

表2 半夏瀉心湯關鍵作用靶點與有效化學成分的分子對接結果

這些化學成分共作用于81 個靶蛋白，其中有29個作用靶蛋白是與慢性胃炎的發病機制相關的，包括MMP1、MMP2（基質金屬蛋白酶1、2）、CASP（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶）、PTGS1、PTGS2（前列腺素內過氧化物酶1、2）、SOD1(超氧化物歧化酶1)、NOS2（一氧化氮合酶2）等，對其進行生物學過程分析發現這些作用靶蛋白參與機體對機械刺激的反應、調控細胞凋亡、調節脂質代謝、調控不飽和脂肪酸代謝過程、對神經遞質和活性氧代謝過程的調節等，并且是多個作用靶點一同調控，如BAX、CASP3 和CASP8 調控細胞凋亡。同時，這也說明中醫藥治療疾病是整體協同多靶向作用的特點。

通過對半夏瀉心湯的作用靶點進行信號通路富集分析，得到50 條信號通路，包括NF-κB 信號通路、HIF-1 信號通路、VEGF 信號通路、IL-17 信號通路等。這些通路中很多與慢性胃炎發病機制密切相關。如NF-κB 是炎癥反應的一個重要物質，其可以促進多種促炎因子產生，使整個炎癥擴大，進而損害靶組織，已有文獻[23]表明，半夏瀉心湯全方及各組分均能根除Hp并抑制TLRs/NF-κB 信號通路；激活血管內皮生長因子（VEGF）/血管內皮生長因子受體途徑，可以啟動信號級聯，促進內皮細胞生長、遷移和分化，加速腫瘤血管的形成，在慢性萎縮性胃炎和胃癌的發生發展有著重要作用[24]；缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)是參與機體氧穩態失衡調節的一個核心因子,當機體處于低氧或缺氧環境下,HIF-1α 可啟動其下游基因VEGF，在卒中、組織缺血、炎癥、腫瘤的發生和發展中發揮重要作用[25]；IL-17在幽門螺旋桿菌感染引起的炎癥反應中起重要作用，除能增強IL-8 的表達外,IL-17 還能調節與胃炎、胃潰瘍和胃癌有關的其他分子的表達[26]；綜上所述，推測半夏瀉心湯通過槲皮素、黃芩苷、人參皂苷、小檗堿等有效成分，調控機體的NOS2、BAX、PTGS1、CASP 等靶蛋白以及 NF-κB 信號通路、HIF-1 信號通路、VEGF 信號通路等信號通路干預慢性胃炎的發生發展。

本研究通過系統藥理學系統性的探究半夏瀉心湯對慢性胃炎的效應機制，科學地收集和預測半夏瀉心湯的有效化學成分和作用靶點，以及所參與生物學過程和信號通路信息，由于中藥及其復方所含化學成分多樣且復雜,真正的藥效物質基礎目前還有很多尚未挖掘到,數據庫收錄的信息尚不全面，有些防治疾病的分子機制也尚未明確，因此，本研究只是基于信息大數據的收集和整理預測，具有一定的局限性和不足，后期仍需到真實世界中進行實驗驗證。