血瘀質非創傷性股骨頭壞死與VEGF、NO、Hcy的相關性研究＊

胡星榮，李盛華，周明旺，肖 振，劉一飛，陳彥同，王鵬志

（1. 甘肅中醫藥大學 蘭州 730020；2. 甘肅省中醫院 蘭州 730050）

股骨頭壞死是由于股骨頭動脈缺血或中斷，導致骨細胞和骨髓成分部分死亡，從而致使股骨頭結構改變、塌陷，引發髖關節疼痛及功能障礙的一種難治性骨科疾病[1-3]。也是青年人群（33-38歲）致殘和髖關節置換的主要原因[4]。我國現有近700萬人罹患該病，男女比例約為2.5:1[5]。其中非創傷性股骨頭壞死（Nontraumatic osteonecrosis of femoralhead，NONFH）居第二位，隨著對該病發病機制研究的不斷深入，出現了血管內凝血紊亂、脂肪栓塞、脂質代謝紊亂、細胞毒性、細胞損傷及基因多態性等多種壞死學說。但由于其發病機制較復雜，仍未能全面闡釋其發病機理，由此導致對NONFH 的保髖療法難以達到理想的效果，課題組前期研究結果顯示血瘀質為NONFH 高發體質之一[6]，同時傳統中醫藥防治股骨頭壞死的作用逐漸得到眾多學者的認可[3,7]，因此研究血瘀質與NONFH 間的內在關系對防治該病具有重要的臨床意義，故本研究通過分析NONFH 壞死體積百分比與血瘀質評分及血清指標的相關性，為防治NONFH提供參考。

1 臨床資料

1.1 病例診斷及納入標準

診斷及分期：參照《成人股骨頭壞死臨床診療指南(2016)》和國際骨微循環研究協會（Association Research Circulation Osseous，ARCO）分期系統[3,8]。

納入標準：①符合診斷標準的股骨頭壞死患者（包括接受手術或中醫藥對癥治療者）；②年齡18-60歲；③愿意接受本次科研調查研究者。排除標準：①診斷為創傷性股骨頭壞死的患者；②妊娠或哺乳期婦女，過敏體質者或不能接受本治療方法者；③既往無合并腫瘤心腦血管疾病或近期感染性疾病者；④近1年應用激素類或大量飲酒者；⑤近期無感染性疾病以及其他嚴重代謝異常疾病患者；⑥精神病患者、智力障礙者；⑦正在參加其他臨床試驗的患者。剔除和脫落標準：有下述任何1項者即可排除：①患者依從性差，未能按照要求填寫者。②采集項目不完整，缺項多于20%者。③體質分型判定為兼夾體質者。本研究經醫院倫理委員會討論并獲得批準，與受試者簽訂知情同意書。

1.2 建立數據庫

股骨頭壞死數據庫病例來源于甘肅省中醫院關節一、二、三科住院患者。對NONFH 患者血瘀質評定分值。（中醫體質判定及評分：參照《中醫體質分類與判定》標準制訂調查表判定中醫體質[9]）。

1.3 一般材料

按照隨機數生成器軟件產生的隨機數抽取數據庫 中 2018 年 10 月 至 2019 年 10 月 NONFH 病 例 19 例（見表1）。共34髖，左髖壞死2例，右髖壞死2例，雙髖壞死15 例。（7 例激素性NONFH 中因類風濕性關節炎激素治療 4 例，1 例男性，3 例女性，平均年齡 50±4.97歲；因腰椎間盤突出癥激素治療2 例，年齡分別為52、54 歲。2 例為酒精性股骨頭壞死患者，飲酒量均＞100 ml/天，飲酒時間均＞10 年，均為男性，年齡分別為48、50 歲。10 例為特發性股骨頭壞死患者，6 例男性，4 例女性，平均年齡50.6±4.5歲）。

2 研究方法

2.1 血清指標檢測

因NONFH 分布不集中，故指定專職調查者進行病例的收集和血清樣本采集。

患者禁食10 h 后，于入院第二天空腹采集5 ml 晨間肘正中靜脈血，置于采血管，在2 h 以內，4℃離心機1 500 r/m，離心10 min，吸取血清等量分裝于兩支1.5 ml EP 管中，貯存于-80℃冰箱中。其中一管采用人ELISA 試劑盒NO、VEGF(江蘇省酶免公司)檢測血清。另一管使用全自動生化分析儀[日立高新技術（上海）國際貿易有限公司，標準號：YZB/JAP1498-2014，型號：日立LABOSPECT 008 AS]檢測血清Hcy（酶循環法）水平。

2.2 CT重建測量股骨頭壞死體積

患者仰臥于CT 掃描床上，以飛利浦Brilliance 128排螺旋對雙側髖臼上緣3.0 cm 到大轉子頂點下15 cm范圍內沿橫斷面連續掃描。掃描條件：選擇軟組織窗（前期試驗軟組織窗較骨窗能保存更多掃描信息，三維重建后擬合度更佳），電壓120 kV，像素大小0.43 mm，層厚0.625 mm，共142層，掃描數據以Dicom3.0標準直接存入移動硬盤備用。由關節專科兩位副主任醫師經雙盲法獨立評閱CT及X線片，結合病史和臨床表現診斷為NONFH。

2.2.1 建模環境

電腦配置：AMDAthlon64 3200+中央處理器、2G內存、15.6 英寸液晶顯示器、64M 顯存、ATI 8550 顯卡、Win7 操作系統；軟件：醫學3-D 圖像生成及編輯處理軟件Mimic17.0（Materialise公司，比利時）。

2.2.2 建立幾何模型

將DICOM 影像導入交互式醫學影像控制系統Mimics17.0 軟件（Materialize，Inc.，比利時）。首先經圖像定位，使用閾值分割HounsField 將骨骼和軟組織分離（見圖1）建立蒙板圖層；然后通過區域增長選取股骨頭正常區域；將該蒙板清除，保留閾值，再使用多層編輯工具從股骨頭頂層逐層選取該閾值股骨頭正常區域（見圖2）；最后，通過蒙板重建Custon 3D 計算方式建立股骨頭三維幾何模型，同樣方法對股骨頭壞死區域建模（見圖3、圖4）。

自動計算生成的壞死股骨頭的體積（V壞）和正常區域體積（V正）（見圖5），計算總體積（V總）=V正+V壞，單側NONFH 以患側的壞死率代表總壞死率，雙側NONFH 以雙側壞死率的平均值代表總壞死率（見表1）。

2.3 觀察指標

CT三維重建計算總壞死率（V/V%）（見表1），血瘀質評分值，檢測血清NO（μmold·L-1）、VEGF（pg·mL-1）、Hcy（μmold·L-1）。

2.4 統計學方法

采用SPSS 25.0 軟件分析，總壞死率以百分比（%）表示，血瘀質評分及血清NO、VEGF、Hcy以均數±標準差（）表示。對于計量資料采用Pearson 相關性分析，對于等級資料采用Spearman 相關性分析，P＜0.05差異有統計學意義，P＜0.01差異有顯著統計學意義。

圖1 閾值分割

圖2 正常區域選擇

圖3 正常區三維建模

圖4 壞死區三維建模

圖5 壞死體積占比

3 結果

3.1 壞死率與壞死分期的一致性

總壞死率與雙側壞死分期具有明顯相關性（P＜0.01，r左=0.655；r右=0.579）（見表1）。表明應用精確總壞死率可以代表股骨頭壞死程度，以便后續統計分析。

3.2 總壞死率、血瘀質與各指標的相關性

總壞死率與NO、VEGF、Hcy 具有相關性，根據相關系數r 判斷，相關性依次為NO ＞ VEGF＞ Hcy；血瘀質評分與總壞死率也存在一定相關性，但相關度較小（r=0.575）（見表2，圖6）。血瘀質與血清Hcy 密切正相關（r=0.824）（見圖7），而與NO、VEGF 未見明顯相關。

表1 股骨頭總壞死率與壞死分期相關性分析（,%）

表1 股骨頭總壞死率與壞死分期相關性分析（,%）

注：NONFH 分期與股骨頭總壞死率（V/V%）的相關性檢驗Δ P＜0.01。

P值0.002ΔΔ 0.009ΔΔ相關系數r 0.655 0.579部位左側壞死率右側壞死率總壞死率例數17 17 19壞死率（V/V%）29.61±13.12 35.75±17.40 36.40±9.76

圖6 壞死率與各指標的相關性比較

表2 總壞死率與各血清指標和血瘀質評分相關性檢驗（）

表2 總壞死率與各血清指標和血瘀質評分相關性檢驗（）

注：與股骨頭總壞死率（V/V%）的相關性 ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；與血瘀質的相關性 *P＜0.01。

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圖7 血瘀質與Hcy相關性

4 討論

NONFH 屬于中醫“骨蝕”、“骨痹”等病癥范疇，因其發病隱匿，現對保髖治療仍無統一標準，因此對該病的預防尤為重要。而中醫藥防治NONFH 已被廣大學者所接受，通過對高危體質人群進行調體干預，可有效預防NONFH發生。

近年來學者對NONFH 的中醫體質與基因多態性關系的研究較為關注，兩者對疾病的易感性方面具有相似的理論和研究證據[9-11]。中醫體質學說源于《靈樞·陰陽二十五人》，是指人體相對穩定的固有特質，也是人在生長、發育過程中與外環境相適應的個性特征。它與人們的生活習慣、飲食結構差異有較大關系。NO 在體內分布較為廣泛，具有舒張血管平滑肌的作用[12]，它與中醫體質間存在一定的相關性[13]。研究[10,14]證實：內皮型一氧化氮合成酶（eNOS）的基因多態性攜帶rs1799983 的t 等位基因顯著降低了NONFH 發病風險；而eNOS 的4b/a 多態性的等位基因a 與特發性和繼發性股骨頭壞死之間也存在顯著相關性。VEGF 可促進血管內皮細胞增殖，增加血管通透性。Hong 等[15]進行了一項 Meta 分析顯示：VEGF 基因的634G/C 多態性與股骨頭壞死的發病具有顯著關聯性。Zhou 等[11]對 1 025 例股骨頭壞死患者和 1 730 例健康人群進行了基于NO 和VEGF 2 個基因的多態性Meta 分析，結果顯示：具有 VEGF rs2010963 G＞C 和eNOS rs2070744 T＞C 基因的患者更易罹患股骨頭壞死。由此可見NO 和VEGF 與股骨頭壞死的發病具有密切關系。

Hcy為蛋氨酸和半胱氨酸代謝過程中產生的重要中間產物，其濃度維持在較低水平。研究[16]表明：葉酸和VitB12 共同參Hcy 的代謝，大量飲酒或飲食中缺乏葉酸和VitB12 均可致血清Hcy 明顯升高。高濃度的Hcy 可使NO 失活，造成血管平滑肌舒張功能減退，導致血管功能障礙[17-18]；同時Hcy 可導致活性氧簇（Eactive oxygen species，ROS）產生的時間依賴性增加，誘導VEGF-VEGFR2-FAK 信號軸激活，使內皮功能修復出現障礙[18]，最終導致股骨頭血供中斷而壞死。 而Hcy 是由亞甲基四氫葉酸還原酶（Methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）基因來調控，多項研究[19-20]證實：MTHFR基因C677T位點的多態性與股骨頭壞死關系十分緊密。

本研究發現，NONFH 患者的血清Hcy與血瘀質評分呈較強正相關，結合本課題組前期研究結果：血瘀質為 NONFH 的高發體質之一[6]，提示：NONFH 的發生與Hcy 升高有較大關系，Hcy 升高可能是導致血瘀體質的重要原因之一。但此次研究中血瘀質評分和Hcy水平對NONFH壞死率的相關性均較低，推測Hcy增高可能僅是NONFH 的誘因，對NONFH 的進展速度關系較小。

VEGF 在股骨頭壞死區域單位體積內含量降低[21]，但本研究表明：血清VEGF 水平隨壞死率的增加升高，提示可能股骨頭內血管受損總量隨壞死體積的增加而增加，出現血清VEGF升高。而NO是否也存在與VEGF相同的機制仍需進一步深入研究。

由此推測，血瘀質NONFH 患者因個人生活和飲食習慣以及自身遺傳等影響，可能通過MTHFR 基因調控后血清Hcy 的濃度較其他體質人群更高，激活了ROS-VEGF-VEGFR2-FAK 信號軸，使股骨頭局部單位體積內NO、VEGF 水平降低，加劇股骨頭血流中斷，故較其他體質更易發生股骨頭壞死。

本試驗通過CT 三維重建計算壞死體積率較ARCO 等級分期能更精確表達壞死嚴重程度；對于血瘀體質根據評分進行分析較二分類變量更易體現體質的漸變性和兼夾體質。但因NONFH 發病隱匿未收集到早期NONFH病例，結果可能存在偏倚。

綜上所述，盡管基因多態性可以預測患病的易感性，但基因調控蛋白的合成兩者不在同一層面，具有復雜性，存在多個基因或一個基因的多個位點同時調控一個蛋白，多種蛋白參與股骨頭壞死的發病，其研究結果對篩查易感人群仍有局限性。

與此相反，中藥對機體功能狀態的調整與調節基因表達和對表達的修飾有關，且中藥可通過多基因、多靶點改變蛋白性狀和功能。益氣活血類中藥如黃芪、當歸為補氣血、活血化瘀常用藥對，它能夠通過調節細胞增殖相關基因cyclin D、c-fos、c-myc 和PCNA，以及細胞外基質代謝相關基因MMP-2、MMP-9、OPN 和凋亡基因Bcl-2、caspase-3、VEGF 等的表達，從而發揮調節血管平滑肌細胞表型和抑制其增殖的作用，具有擴張血管和抗凝血功能[22-23]。對NONFH 的高危體質人群在進行激素治療，或長期飲酒之人予以益氣、活血化瘀中藥或食材，可預防該病的發生，但仍需進一步研究。

隨著循證醫學對中藥治療股骨頭壞死臨床療效的再評價和再認識，中醫藥治療NONFH 的療效已得到普遍認可[6,24-25]。在理論方面也有所發展，提出了：從瘀、痰、濕、毒等論治股骨頭壞死[26-29]。預期隨著理論深入、規范、科學的研究和臨床驗證，中醫藥防治股骨頭壞死不僅可以改善患者的生活質量，還能減輕經濟負擔。