黃芪提取液對糖尿病潰瘍大鼠Wnt/β-Catenin信號通路調控表皮干細胞增殖分化的影響＊

仇蓮胤，闕華發，屈可伸，孫 偉，郭樹豫，李 陽

（1. 上海中醫藥大學 上海 201203；2. 上海中醫藥大學附屬龍華醫院 上海 200032）

糖尿病性潰瘍是糖尿病患者常見而又嚴重的慢性并發癥之一，是糖尿病患者致殘和致死的主要原因之一，嚴重影響患者的身心健康及生命質量，是臨床亟待解決的難題。顧氏外科是我國著名的中醫外科世家，長期致力于慢性皮膚潰瘍的治療，療效顯著。傳承顧氏外科學術思想與臨證經驗，本課題組開展了中醫藥治療糖尿病性潰瘍全面系統的臨床、基礎研究，既往課題組一系列的臨床實踐及實驗研究[1-5]，已發現并證實了補虛化瘀復方及其拆方補虛益氣生肌中藥能夠多途徑、多靶點、多環節地發揮作用，提高機體修復能力，有效促進創面愈合。本研究在此基礎上，以“補虛生肌”治療原則為指導，采用補虛中藥黃芪有效成分提取液，擬從Wnt/β-catenin 信號傳導通路及表皮干細胞的角度，探討其修復糖尿病潰瘍創面的作用機制及作用靶點，為中醫“肌平皮長”理論提供客觀依據，為中醫藥促進糖尿病潰瘍愈合提供新的治療靶點，為臨床治療提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

雄性 SPF 級 Wistar 大鼠 192 只，8 周齡，體質量160-205 g（上海斯萊克實驗動物責任有限公司），實驗動物的許可證號：SCXK（滬）2017-0005。本研究涉及的動物實驗操作均在上海中醫藥大學動物實驗中心進行，許可證號：SYXK（滬）2014-0008，實驗申請經過上海中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準，倫理編號：PZSHUTCM19011113。

1.1.2 藥物

黃芪注射液10 ml/支（正大青春寶藥業有限公司，國藥準字Z3302017）。根據文獻[6]計算出人鼠等效劑量，以每支注射液相當于原藥材20 g 得出觀察組用藥劑量。觀察組黃芪低劑量組、中劑量組、高劑量組生黃芪用藥分別為15 g、30 g、60 g，人鼠等效劑量分別為1.35 g·kg-1、2.7 g·kg-1、5.4 g·kg-1，用 藥 劑 量 分 別 為0.675 ml、1.39 ml、2.7 ml。

1.1.3 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素（批號：S0130，美國sigma 公司）；兔抗增殖細胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA）單克隆抗體（批號：13110）、兔抗β1整合素單克隆抗體（批號：34941）（均為CST 公司）；兔抗角蛋白19（Keratin19，K19）多克隆抗體（批號：1910712-1-AP）、小鼠抗細胞周期蛋白D1（CyclinD1）單克隆抗體（批號：160186-1-Ig）、兔抗β-連環素（β-Catenin）多克隆抗體（批號：51067-2-AP）、兔抗糖原合成激酶-3β（GSK-3β）多克隆抗體（批號：22104-1-AP），鼠抗GADPH 單克隆抗體（批號：60004-1-Ig）（均為Proteintech 公司）；兔抗 C-myc 單克隆抗體（批號：ab32072）、兔抗HistoneH3 多克隆抗體（批號：Ab1971）（均為Abcam 公司）；蛋白Marker（批號：26616，Thermo Fisher Scientific）；ECL 化學發光檢測試劑盒（批號：abs920，愛必信生物科技有限公司）；細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒（批號：P0028，Beyotime 公司）；BCA 蛋白定量試劑盒（批號：PICPI23223，thermo 公司）；SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒（批號：G2003，谷歌生物）；Bradford 蛋白濃度測定試劑盒（批號：P0006，碧云天公司）；cDNA 合成試劑盒（批號：11123ES60）、RealTime-PCR 試劑盒（批號：11123ES60）（均為上海翊圣公司）；血糖儀（穩豪倍易型，美國強生公司）；酶標儀（型號：RT-6100，深圳雷杜生命科學股份有限公司）；電泳儀（型號：1658003，bio-rad 公司）；多功能化學發光成像系統（型號：ChemiScope6000 Pro，上海勤翔科學儀器有限公司）；PCR 儀（型號：ABI7500，ABI公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型建立及分組

大鼠適應性飼養一周，采用隨機數字表法分為正常對照組（32 只）和造模組（160）只。造模組大鼠在禁食12 h后，給予由檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液（pH4.2、0.1 mol·L-1）配制成 1% STZ 溶液，以質量為 60 mg·kg-1單次腹腔內注射，對照組腹腔注射等容積的0.1 mol·L-1檸檬酸-檸檬酸鈉溶液。造模后第2 天、第7 天，尾靜脈取血測定空腹血糖，血糖 2 次均＞16.7 mmol·L-1，即成糖尿病大鼠模型[7-8]。每周檢測大鼠血糖1 次，飼養8 周后，大鼠異氟烷吸入麻醉，后背部剃毛，用直徑20 mm 的塑料瓶蓋在造模區（背部靠近腰椎一側）標記，在無菌條件下，以外科方法作深達深筋膜、直徑為20 mm的全層皮膚缺損，形成糖尿病大鼠全層皮膚缺損開放性創面模型。糖尿病造模組再隨機分為模型組、黃芪注射液低劑量組（低劑量組）、黃芪注射液中劑量組（中劑量組）、黃芪注射液高劑量組（高劑量組），各40只。

1.2.2 給藥和取材

各組于造模后次日開始經口灌胃給藥，低、中、高劑量三組予以黃芪提取液灌胃，劑量分別為0.675 ml、1.39 ml、2.7 ml，1 次/d，正常對照組、模型組給予生理鹽水灌胃，每次 2 ml，1 次/d，分別于造模后第 7 天、第14 天、第21 天取材。大鼠創面換藥均以常規清潔，外敷生理鹽水紗布，加蓋消毒干紗布，用膠布固定。

每組隨機選取10只大鼠觀察創面基本情況，測量創面面積，計算創面愈合率，觀察至創面愈合結束，統計創面愈合時間。在造模后第7 天、第14 天、第21 天每組分別隨機取選取6 只大鼠，采集包含創面內組織及創周皮膚組織并處死大鼠。創面組織部分于-80℃冰箱凍存，用于 RealTime-PCR 及 WesternBlot 檢測，部分用于免疫組化染色。

1.2.3 觀測指標

1.2.3.1 創面愈合情況

用藥后測量創面面積，使用標尺作為標準，固定高度垂直創面使用數碼相機拍照，使用Image pro plus 6.0 軟件描畫創面輪廓，經軟件分析轉換為面積，得出原始創面面積，每組大鼠分別于造模當天、造模后第3天、第7天、第14天、第21天用此方法拍照記錄創面面積，并計算創面愈合率。計算創面愈合率（%）=（原始創面面積-未愈合創面面積）/原始創面面積×100%。各組均觀察至創面愈合結束，計算創面愈合時間。

1.2.3.2 RealTime-PCR 檢測

給藥后第7、14、21 天各組創面組織Wnt1、Wnt3a、β-連環素（β-Catenin）、糖原合成激酶3β（GSK-3β）mRNA 表達。按照總RNA 提取試劑盒說明提取總RNA，分光光度計測定RNA 濃度和純度。Wnt1、Wnt3a、β-Catenin、GSK-3β、β-actin 的 PCR 引物由上海基科生物化學有限公司設計合成，Wnt1、Wnt3a、β-Catenin、GSK-3β 基因 ID 號分別為：24881、303181、84353、84027，引物序列見表1。運用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，得到cDNA 原液。隨后配制qReal-time PCR 反應體系，以SYBRGreen 法進行擴增，擴增程序為95℃ 5 min（預變性），之后95℃ 10 s（變性），55℃ 20 s（退火），85℃ 20 s（延伸），40 個循環擴增完畢。根據Real-time PCR 原始檢測結果，按照 2－ΔΔCt相對定量計算公式，計算各樣品組織中Wnt1、Wnt3a、β-Catenin、GSK-3β mRNA的相對表達量。

1.2.3.3 Western Blot檢測

采用 Western Blot 檢測給藥后第 7、14、21 天各組創面組織β-Catenin、GSK-3β、細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、C-myc 蛋白表達及β-Catenin 核內表達水平。稱取創面組織剪碎研磨后，采用RIPA 裂解液提取組織總蛋白，采用組織勻漿液提取核蛋白，取上清液以BCA 法測定蛋白濃度，而后蛋白樣品在95℃變性10 min。各取樣品5 μl行SDS-PAGE 電泳分離并轉至NC膜，在含5%脫脂奶粉封閉液中封閉1 h，加入β-Catenin、GSK-3β、CyclinD1、C-myc、GADPH、Histone H3 一抗，4℃孵育過夜，次日將膜拿出在TBST 緩沖液中漂洗3 次/5 min，加入二抗溶液，37℃孵育2 h，TBST洗膜后，取出NC 膜，根據ECL 化學發光檢測試劑盒說明，顯色、定影，凝膠成像系統成像，其中核蛋白轉膜需要使用PVDF膜，分別以GADPH蛋白、Histone H3蛋白作為內參，結果以各組β-Catenin、GSK-3β、C-myc、CyclinD1、β-Catenin入核電泳條帶灰度值比值表示。

表1 PCR引物序列

1.2.3.4 免疫組化法檢測

采用免疫組化法檢測給藥后第7、14、21天各組創面組織角蛋白19（Keratin 19，K19）、β1整合素、增殖細胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA）表達。皮膚組織制成切片，再經脫蠟、水化、修復后，加一抗（β1整合素：1：100，PCNA：1：3000，keratin 19：1：500），4℃過夜，洗滌后加二抗，37℃孵育50 min，添加DAB工作液，濕盒孵育40 s，蘇木素復染，無水酒精分化、脫水、透明化，封片。顯微鏡觀察，利用Image pro plus 6.0圖像分析軟件進行測量分析，計算K19、β1整合素、PCNA陽性表達區域的平均光密度值（Average Optical Density，AOD）。

1.2.3.5 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，實驗中計量資料以均數±標準差（x±s）來表示，檢驗方差齊性，方差齊者采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey法檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 黃芪提取液對糖尿病大鼠創面愈合率的影響

與正常對照組比較，模型組在給藥后第3天、7天、14 天、21 天時的創面愈合率明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，高劑量組給藥后第14、21 天時創面愈合率顯著提高（P＜0.01），中劑量組則僅在給藥后第14天創面愈合率明顯提高（P＜0.05），低劑量組在這三個時間點的創面愈合率差異不明顯無統計學意義（P＞0.05）；低、中、高各劑量組之間比較，高劑量組給藥后第14天創面愈合率高于低劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05）。創面愈合情況見圖1，表2。

2.2 黃芪提取液對糖尿病大鼠創面愈合時間的影響

與正常對照組比較，模型組創面愈合時間明顯延長（P＜0.01）；與模型組比較，僅高劑量組創面愈合時間少于模型組（P＜0.05），余各組差異不明顯無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

圖1 各組大鼠不同時間點創面愈合情況

表2 黃芪提取液對不同時間創面愈合率的影響（%）

2.3 黃芪提取液對糖尿病大鼠創面組織Wnt1、Wnt3a、β-Catenin、GSK-3β mRNA表達的影響

與正常對照組比較，模型組創面組織Wnt1、Wnt3a、β-Catenin mRNA 的表達在創面造模后第 7、14、21 天時均明顯降低（P＜0.01），GSK-3β mRNA 表達明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，高劑量組創面組織 Wnt1、Wnt3a、β-Catenin mRNA 的表達在給藥后第7、14、21 天時增加（P＜0.05），GSK-3β mRNA 表達降低（P＜0.05）。見表4。

表3 黃芪提取液對創面愈合時間的影響（d）

2.4 黃芪提取液對糖尿病大鼠創面組織β-Catenin、GSK-3β、CyclinD1、C-myc 及 β-Catenin 核內表達的影響

與正常對照組比較，模型組創面組織β-Catenin、CyclinD1蛋白表達在創面造模后第7、14、21天時均明顯降低（P＜0.01），GSK-3β的表達明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，高劑量組創面組織β-Catenin、C-myc、CyclinD1 蛋白表達在給藥后第7、14、21 天時增加（P＜0.05），GSK-3β表達降低（P＜0.05），高劑量組創面組織β-Catenin入核蛋白表達在給藥后第7、14天時明顯增加（P＜0.01）；各劑量組之間比較，高劑量組創面組織β-Catenin、C-myc、CyclinD1蛋白表達在給藥后第7、14、21天時明顯高于低劑量組，差異有統計學意義（P＜0.01），而GSK-3β表達降低（P＜0.05）。見表5、表6和圖2。

表4 黃芪提取液對創面組織Wnt1、Wnt3a、β-Catenin、GSK-3β mRNA表達的影響（n=6）

2.5 黃芪提取液對糖尿病大鼠創面組織K19、β1整合素、PCNA表達的影響

與正常對照組比較，模型組創面組織K19、β1 整合素、PCNA表達在創面造模后第7、14、21天時明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，中、高劑量組創面組織K19、β1 整合素、PCNA 的表達在給藥后第 7、14、21 天時明顯增加（P＜0.01）；各劑量組之間比較，高劑量組K19、β1 整合素、PCNA 表達在給藥后第 7、14、21 天時明顯高于低劑量組（P＜0.01）。見表7、圖3。

表5 黃芪提取液對創面組織β-Catenin、GSK-3β、C-myc、CyclinD1蛋白表達的影響（n=6）

表6 黃芪提取液對創面組織β-Catenin核內表達的影響（n=6）

3 討論

表7 黃芪提取液對創面組織K19、β1整合素、PCNA表達的影響（n=6）

圖3 各組給藥后第14天K19、β1整合素、PCNA免疫組化染色（×400）

糖尿病潰瘍屬中醫“消渴”、“脫疽”“潰瘍”等范疇，中醫在治療糖尿病潰瘍方面有著悠久的歷史，且療效顯著，積累了豐富的臨床經驗，總結了“腐祛肌生、肌平皮長”的潰瘍愈合規律。顧氏外科第四代傳人外科名家唐漢鈞教授治療糖尿病性潰瘍主張“補虛生肌”、“化瘀生肌”理論，認為正氣虛損，正氣不足是發病之本，潰瘍難以愈合的根本原因。依據《素問》“治病必求其本”、“虛者補之、損者益之”的理論，確立補虛生肌的治療法則。中藥黃芪味甘，性溫，歸肺、脾經，甘能益氣，溫能補虛，有補益脾肺、益氣升陽、固表止汗、利水消腫、托瘡生肌的功效，被譽為“瘡家之圣藥”。黃芪長于補脾肺之氣，中醫理論強調“脾主肌肉”、“肺主皮毛”，脾為氣血生化之源，全身肌肉都依靠脾胃運化的水谷精微化生氣血來營養，脾旺則正氣足，氣血生化充足，肌肉得以濡潤而豐滿；肺輸布津液，宣發衛氣外達皮毛，充養皮膚，瘡面更易愈合。

現代藥理學研究[9]證明，黃芪的有效成分主要為黃芪皂苷、黃芪多糖、黃芪總酮等，在改善局部微循環、促進成纖維細胞、合成膠原蛋白、修復角質形成細胞、調節細胞因子等方面起著一定的作用[10]。黃芪注射液由先進工藝從中藥黃芪中提取有效成分精制而成，皂苷類、黃酮類、多糖類為其功效的主要物質基礎[11]，相較于傳統水煎有效成分穩定，雜質較少，且已在臨床上廣泛應用，基于相關臨床研究[12-13]表明，黃芪注射液可顯著調節糖尿病皮膚潰瘍患者炎癥細胞因子及氧化應激物水平促進創面愈合，還能縮短傷口愈合時間，減輕不適癥狀。因而，本實驗選取此中成藥試劑進行灌胃藥物干預，旨在揭示黃芪促進上皮化，加速糖尿病潰瘍創面愈合的機制。在本實驗中，糖尿病模型組大鼠創面愈合緩慢，在創面造模后的第3、7、14、21 天創面愈合率明顯低于正常對照組大鼠，且創面愈合時間明顯延長，而黃芪藥物干預組創面愈合率較模型組得到改善，尤其是高劑量組在給藥第14、21天差異更為明顯，這表明黃芪提取液能有效促進糖尿病潰瘍愈合，尤其在創面修復增殖階段效果顯著，且與劑量依賴有一定關系。

糖尿病潰瘍創面愈合涉及局部炎癥反應、增殖階段和組織塑形重建這3個密切聯系、交互重疊的階段，其中增殖階段的血管新生、肉芽形成、上皮化是創面修復的關鍵環節[14]。已有研究[15]表明，糖尿病創面肉芽生成減少，再上皮化延遲或缺失，創面愈合緩慢。再上皮化障礙是糖尿病潰瘍創面難愈合的重要原因之一。表皮干細胞作為皮膚組織的特異性干細胞，是皮膚組織再生和創傷修復的關鍵細胞，主動參與創面的修復，促進創面再上皮化，其位于皮膚的基底層，具有無限增殖和分化潛能，是創面再上皮化過程中各層表皮細胞的源細胞，表皮細胞的更新正是通過其向上增殖分化來完成[16-18]。已有研究[19]發現，糖尿病創面愈合過程中表皮干細胞呈現出數量少、活性低的動態變化，影響上皮化過程，導致創面愈合延遲。K19 和β1整合素是目前公認的表皮干細胞特異性相對較高的標記物[20]，以K19 和β1 整合素同時陽性表達來鑒別創周表皮干細胞。PCNA 是用作評價細胞增殖狀態的指標，能準確反映細胞生長速度和狀態[21]。

Wnt 通路是由Wnt 蛋白及其受體、調節蛋白等組成的信號轉導通路，研究[22]認為其參與創面愈合的過程，發揮著調控皮膚及其附屬器的發育、促進創面血管新生及上皮重塑的功能。Wnt/β-Catenin 通路是經典Wnt 信號通路，機制較為清晰與表皮干細胞增殖分化關系密切。通常情況下，Wnt/β-Catenin轉導信號中啟動信號蛋白Wnt 蛋白處于靜息狀態，皮膚損傷時，Wnt蛋白通過自分泌或旁分泌作用與位于細胞膜的相關受體結合，降低GSK3β 的活性，抑制β-Catenin 的磷酸化,，使β-Catenin 在胞內集聚，最后游離β-Catenin進入細胞核內與T 細胞因子（TCF）/淋巴細胞因子（LEF）結合，激活信號通路，啟動靶基因C-myc、CyclinD1 等的表達[23]。該經典通路的標志即是β-Catenin 的積累，并向核內轉移[24]。β-Catenin 是 Wnt經典信號通路中的核心關鍵，其在胞質中的含量高低直接影響著核內靶基因的表達，對表皮干細胞增殖分化起一定作用[25]。有研究[26-27]表明，Wnt 及 β-Catenin 表達增強，表皮細胞增殖、分化能力加強，創面愈合速度加快。而已知的Wnt 蛋白家族成員中，能激活經典通路的有 Wnt1、Wnt3a[28]，GSK3β 是決定降解復合體中β-Catenin磷酸化的重要激酶，起著關鍵性的負向調節作用[29-30]。

本實驗在糖尿病潰瘍大鼠模型證實，在創面造模后第7、14、21 天，β-Catenin 在糖尿病大鼠創面組織中呈低表達，GSK-3β 蛋白表達增加，CyclinD1、C-myc 蛋白表達下降，β1 整合素、K19、PCNA 表達較正常對照組明顯減少，從而進一步表示Wnt/β-Catenin 信號通路表達下調，創面表皮干細胞數量少，增殖能力減弱，這與以往的實驗報道結果基本一致[21]。在通過黃芪注射液給藥之后，實驗結果顯示高劑量組大鼠創面組織在給藥第 7、14、21 天 Wnt1、Wnt3a、β-Catenin mRNA水平較模型組明顯上升，GSK-3β mRNA 水平下降，β-Catenin 與β-Catenin 核內表達水平增加，GSK-3β 蛋白表達下降，下游靶基因C-myc、CyclinD1蛋白的表達較模型組上升，由此說明Wnt/β-Catenin 信號通路活化，β-Catenin 入核激活下游靶基因轉錄，K19、β1整合素、PCNA 陽性表達較模型組明顯增強，進一步說明促進了表皮干細胞的增殖分化，這也是高劑量組大鼠創面愈合率高于模型組，創面愈合時間縮短的內在機制。綜上所述，本研究表明黃芪提取液與Wnt/β-Catenin信號通路活化有關，通過對Wnt1、Wnt3a、β-Catenin、GSK3β 的調控，上調β-Catenin、C-myc、CyclinD1 等蛋白起到調節Wnt/β-Catenin 信號通路的作用，從而影響表皮干細胞的增殖分化，加快創面上皮化的進程，加速糖尿病潰瘍的愈合。本研究揭示了中藥黃芪促進上皮化，加速創面愈合的機制，為糖尿病慢性創面愈合的治療提供新思路。