穿心蓮內酯聯合頭孢西丁對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的協同抑制作用＊

張璐璐 ，包 梅 ，楊偉峰 ，呂 誠 ，肖 誠 ，官福蘭 ，易劍峰 ，李 立，呂 朗，王 毅，譚 勇＊＊

（1. 宜春學院化學與生物工程學院 宜春 336000；2. 中國中醫科學院中醫臨床基礎研究所 北京 100700；3. 中國中醫科學院醫學實驗中心 北京 100700；4. 中日友好醫院臨床醫學研究所 北京 100029；5. 美國耶魯大學醫學院藥理系 紐黑文 CT06520；6. 創新天然藥物與中藥注射劑國家重點實驗室 贛州 341000）

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MethicillinresistantStaphylococcus aureus，MRSA）是臨床上常見的毒性較強的細菌，自首次發現以來，在全球的影響范圍逐年遞增，現已是院內及社區最主要的感染病原菌之一[1，2]。臨床上針對MRSA 感染多采用抗生素療法，代表藥有糖肽類萬古霉素和噁唑烷酮類利奈唑胺[3]。近年來國內外有關耐萬古霉素金黃色葡萄球菌和耐利奈唑胺金黃色葡萄球菌的臨床分離株多有報道，這些抗生素對MRSA的敏感性降低，且其價格昂貴、使用限制多，在臨床治療中逐漸顯示出不足之處[4，5]。積極探索新的藥物替代治療方案已成為目前有效應對MRSA感染的緊迫任務。

頭孢西丁（Cefoxitin，FOX）是二代頭孢菌素，曾作為臨床治療MRSA 的一線用藥，聯合其他β-內酰胺類抗生素對社區獲得性的MRSA 感染具有協同抑制作用[6]。穿心蓮內酯（Andrographolide，AG）作為一種二萜內酯化合物，可從爵床科植物穿心蓮內分離純化得到，是穿心蓮的活性成分之一，具有清熱解毒、免疫調節等作用[7]。有研究表明AG 對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）生物膜（Biofilm，BF）的生長具有抑制作用[8]。AG 難溶于水，故通常經過獨特的磺化工藝制成穿心蓮內酯總磺化物（Andrographolide total sulfonate，AS）以增強水溶性、提高生物利用度[9]。AS是AG使用中的替代品。

FOX 聯合AS 可能對MRSA 發揮協同抑菌作用。本研究采用網絡藥理學技術預測AS 聯合FOX 對MRSA 的作用機制，并根據在不同濃度配比下FOX 和AS 聯合對 MRSA BF 生長的影響，觀察 AS 對 FOX 抗MRSA 活性的協同增效作用。本研究為臨床上AS 聯合FOX 治療MRSA 感染及減輕MRSA 耐藥提供依據，冀希開辟中西藥聯用治療感染性疾病的新思路和新方法。

1 材料

1.1 藥物靶蛋白和MRSA相關基因

在 ChEMBL、ETCM 和 PubChem 數據庫檢索 AS 和FOX 的靶蛋白，剔除非實證獲得和重復者，入選的AS靶蛋白 20 個，FOX 靶蛋白 65；在 Ensembl Bacteria、Uniprot 和PubMed 數據庫中檢索MRSA 致病相關基因，剔除重復者，共入選80個基因。

1.2 菌株

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（ATCC 43300）購自美國ATCC公司。

1.3 主要藥物與試劑

穿心蓮內酯總磺化物標準品（生產批號：20181018）；頭孢西丁（ID：WN67-8BC6）購自中國食品藥品監督管理局；胰蛋白胨（LP0024）和酵母提取物（LP0021）為英國OXOID 公司產品；XTT（X4626）、PMS（P-9625）和TTC（17779-10X10ML-F）為美國Sigma 公司產品；酶標儀為美國伯樂公司生產；分光光度計為上海美譜達儀器廠生產；恒溫恒濕培養箱由上海森信實驗儀器有限公司生產；恒溫搖床由上海孫坤生產；高壓滅菌鍋由日本三洋企業生產。

2 方法

2.1 AS和FOX干預MRSA的作用和機制預測

參考筆者以往的類似研究，把AS、FOX 的靶蛋白及MRSA 相關基因進行格式歸一化處理，然后導入IPA 網絡分析平臺，采用Network analysis 功能模塊構建藥物靶蛋白網絡和MRSA 基因網絡，通過網絡的映射分析，發現AS和FOX干預MRSA的相關靶點[10，11]。

2.2 藥物最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration,MIC）測定

從MRSA平板中挑取單菌落置于3mL LB培養基，37℃、280r·min-1震搖18h。翌日取出菌液，通過分光光度計檢測600nm吸光度值，用LB培養基稀釋菌液至A600=0.02，采取標準微量肉湯稀釋法分別檢測AS、FOX 對 MRSA 的 MIC 值。取無菌 96 孔板，倍比稀釋藥液，其中AS的濃度梯度為50-0.098mg·mL-1，FOX濃度梯度為 64-0.125μg·mL-1，每孔 100μL，再加入菌液100μL。同時設置陰性對照孔和陽性對照孔，其中陰性對照孔僅添加200μL LB 培養基，陽性對照孔加入200μL 菌液。37℃、80%RH 培養 24h 后每孔添加0.25%TTC 30μL，繼續培養30min，肉眼直接觀察培養孔內呈現顏色，紅色代表孔內含菌，以陰性對照孔為參考，判斷MIC值。實驗重復3次。

2.3 AS與FOX作用的最佳抑菌濃度比的確定

采用棋盤法[12，13]。培養基菌液稀釋同方法2.2。使用96孔板，分別對AS、FOX進行倍比稀釋。在96孔板中取8 個孔依次橫向梯度稀釋AS 至7 個梯度，梯度范圍為 25-0.391mg·mL-1。另取一塊新 96 孔板取 8 個孔縱向梯度稀釋FOX 至7 個梯度，梯度范圍為32-0.5μg·mL-1。從已稀釋不同濃度的AS 孔板中用排槍各吸取50μL，從FOX 孔板第二列依次轉移，使得孔板第一列及最后一行中僅含有FOX 或AS，其中填補50μL LB 培養基。最后于所有待測孔內加入100μL菌液，37℃、80%RH培養24h。

以分數抑制濃度指數（fractional inhibitory concentration index，FICI）評判藥物體外的相互作用情況。計算公式為：FICI=MICA/A+MICB/B，公式中A 和B 代表 A 藥和 B 藥各自單用時的 MIC；MICA 和 MICB代表 A 藥和 B 藥聯用時各自的 MIC。當 FICI≦0.5 為協同作用；FICI=0.5-1.0 為相加作用；FICI=1.0-2.0 為無關作用；FICI＞2.0為拮抗作用。

2.4 AS 和FOX 各自單用和聯用對成熟MRSA BF 的影響測定

2.4.1 AS和FOX各自單用對成熟MRSA BF的影響

采用微孔板法[14]。MRSA接種方法同2.2，用LB培養基將菌液稀釋至A600=0.1。于無菌96 孔板中各孔添加菌液100μL，37℃、80%RH 培養24h，生長出成熟的MRSA BF。取一塊新96 孔板稀釋藥液，AS 的濃度梯度 為 50-0.098mg·mL-1，FOX 的 濃 度 梯 度 為 32-0.0625μg·mL-1，每孔100μL 轉移至含菌孔板內，37℃、80%RH 培養24h。采用0.9%氯化鈉溶液洗滌96 孔板兩次，除去孔中未貼壁的細菌，以XTT-PMS（200：1）染液每孔加入40μL進行BF染色，使用酶標儀檢測BF內活菌量（XTT-PMS 450nm）。

2.4.2 AS和FOX聯用對成熟MRSA BF的影響

采用微孔板法。培養基菌液稀釋、培養成熟MRSA BF同方法2.4.1。根據最佳抑菌濃度比，配置相應濃度的AS 及FOX，AS 的濃度選取為1/2MIC（25mg·mL-1）、1/4MIC（12.5mg·mL-1），FOX 的濃度選取為 1/2MIC（16μg·mL-1）、1/4MIC（8μg·mL-1）、1/8MIC（4μg·mL-1），兩兩聯合各 50μL 組成 1/2MIC FOX+1/2MIC AS、1/2MIC FOX+1/4MICAS、1/4MIC FOX+1/2MIC AS、1/4MIC FOX+1/4MIC AS、1/8MIC FOX+1/2MIC AS加入含菌孔板中，37℃、80%RH培養24h。染色及檢測方法同2.4.1。

2.5 統計學分析

實驗數據采用平均數±標準差（x±s）表示，用SPSS軟件進行單因素方差分析，方差齊者采用LSD 進行兩兩對比，方差不齊者進行Dunnet’T3 分析，采用Pearson 法分析被膜內抑菌量與劑量依賴關系的相關性，P＜0.01為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 AS和FOX干預MRSA的作用特點和機制

如圖1 所示，AS 網絡通過溶細胞毒素（Staphylolysin α，Hla）、潘 頓 瓦 倫 丁 殺 白 細 胞 素（Panton-Valentine Leukocidin Toxin，PVL）和纖維連接蛋白結合蛋白B（Fibronectin Binding Protein B，FnbB）影響 MRSA 網絡，FOX 網絡通過 Hla、PVL、Atl 和 SarA影響 MRSA 網絡；AS 和 FOX 共同的作用點 Hla 和 PVL屬于 MRSA 的毒力因子，Atl和 SarA 與 MRSA 的致病性相關；FnbB是耐藥BF形成的關鍵分子。提示AS、FOX對MRSA 有聯合抑制作用，并且推測AS 通過抑制MRSA BF提高FOX對MRSA的敏感性。

3.2 AS、FOX 對 MRSA 的 MIC 值及聯用最佳抑菌濃度比

AS、FOX 對 MRSA 的 MIC 值分別為 50mg·mL-1和32μg·mL-1（圖2、表1），并據此確定棋盤法的起始濃度。AS 和FOX 聯用對MRSA 最佳抑菌濃度比實驗結果表明，AS 與FOX 聯用濃度不同則表現出不同的抗菌效果（圖3、表1）。AS 和FOX 聯用，以25mg·mL-1AS（單用時MIC 的1/2）+4μg·mL-1FOX（單用時MIC 的1/8）作用效果最佳，FICI值=0.625，表現為相加作用。結果提示，AS 與 FOX 聯用可提高 MRSA 對 FOX 的敏感性。

圖1 AS和FOX干預MRSA的分子網絡

圖2 AS、FOX對MRSA的MIC值

圖3 AS與FOX聯用最佳抑菌濃度比

表1 AS和FOX各自單獨及聯用對MRSA的MIC、FICI及作用方式

3.3 AS、FOX對MRSA BF的作用

3.3.1 單用AS、FOX對MRSA BF的作用

如圖 4 所示，當 MRSA BF 成熟后，FOX 單用對膜內活菌數無顯著影響；AS單用可影響BF內的活菌量，8 個濃度劑量（50-0.391mg·mL-1）均產生抑菌效果，并存在劑量依賴關系，提示AS 能使BF 外層膜結構破損而滲透入膜內、殺滅膜內細菌。

3.3.2 聯用AS、FOX對MRSA BF的作用

如圖5 所示，AS 與FOX 聯用優于兩藥單用效果，可顯著影響BF 內活菌量；FOX 不同濃度劑量變化對聯用效果沒有影響，而AS 濃度劑量不同、聯用效果不同。1/2MIC AS 與FOX 聯用作用效果優于1/4MIC AS與FOX 聯用。結果提示，AS 與FOX 聯用的最佳濃度比為1/8MIC FOX+1/2MIC AS。

4 討論

如今由MRSA 造成的感染性疾病逐年增加，MRSA 的院內感染主要分布于呼吸內科、神經外科、ICU 等，來自 Mohnarin2010 年度的報告，MRSA 在 ICU中的檢出率高達79.4%。感染率之高，影響范圍之廣，對全球公共衛生安全產生嚴重威脅[15，16]。MRSA 作為目前世界上嚴重的多藥耐藥菌之一，多種抗生素均已產生耐藥反應。MRSA 具有S. aureus可形成細菌BF的重要特性。BF 的概念最早是Costerton 于1978 年提出[17]，BF 不同于其他耐藥機制具有特異性，BF 是任何一種細菌在生長過程中為適應環境變化，細菌聚集成團，在菌體外圍分泌出可附著于物體表面的物質，這是一種與浮游細菌截然相反的存在形式[18]。因此探索發現針對治療細菌BF 的有效藥物和治療方案始終是醫學領域的熱點話題。MRSA 通過BF 附著于人體內部組織器官或置入性醫療器械表面，機體的免疫系統、呼吸道黏膜上纖毛的擺動、胃腸道蠕動及尿液沖刷等生理活動均難去除入侵的MRSA，BF 的屏障作用有效的阻礙了抗菌藥物對膜內深層細菌的殺滅作用，抗生素、化學消毒劑等亦難以滲透其中，是臨床中導致耐藥產生的重要原因[19]，造成各種慢性難治性感染使MRSA的臨床治療難度加倍。FOX屬于第二代頭孢類抗生素，曾經是治療MRSA 的一線藥物，如今因MRSA 對其敏感性降低而較少用于臨床。AS 作為傳統中藥穿心蓮活性成分提取物的磺化物，長期運用于抗炎抗菌等治療。現研究表明AG 在體外可對MRSA BF 產生抑制作用，并存在劑量依賴關系[20，21]。本研究探索AS 聯合FOX 干預MRSA 的作用，為臨床有效治療MRSA感染開拓新的用藥思路和用藥方案。采用網絡藥理學技術進行藥效及其機制預測是當前藥物研究的重要手段，具有高通量、高效率、低成本、研究結果穩定可靠的特點，廣泛應用在實證研究前的預研究，能夠為實證研究假說的提出提供依據。通過既往文獻報道網絡藥理學的方法可以探討兩藥之間相互作用特征及其機制[22]。本研究首先采用網絡藥理學技術預測AS 和FOX 對MRSA 的作用特點和機制，發現AS 和 FOX 均 對 MRSA 毒 力 因 子 基 因 Atl 和 SarA 有 影響，AS 的作用特點也表現出影響耐藥BF 形成的關鍵基因是FnbB。本研究也開展了AS和FOX各自單獨及聯合干預MRSA的體外實驗，采用棋盤法、微孔板法發現兩藥聯合干預MRSA 具有相加效應，FOX 對成熟的MRSA BF 不具任何作用，而 1/2MIC（25mg·ml-1）的 AS即能夠破壞BF 而使 FOX 僅1/8MIC（4μg/ml）即可有效接觸膜內深層細菌發揮抑菌效果，明顯減低抗生素使用劑量。

圖4 微孔板法檢測AS與FOX對MRSA BF的影響

圖5 微孔板法檢測AS與FOX聯用對MRSA BF的影響

Hla是編碼MRSA主要毒力因子α溶血素的基因，α溶血素的作用可造成紅細胞、白細胞的損傷，甚至可進一步危害皮膚細胞和血管內皮細胞[23]。PVL 編碼殺白細胞素，其通過膜損傷機制致使宿主細胞破裂解離，主動攻擊各類器官組織細胞造成宿主產生貧血、毛細血管出血、白細胞銳減、皮膚壞死、心肌壞死、化膿性炎癥等不良癥狀[24]。AS 和FOX 可能共同作用于這兩個靶點對MRSA 發揮聯合抑制作用。MRSA BF的生成一部分歸因于其細胞表面蛋白識別粘附基質分子的微生物表面組分（microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules，MSCRAMM）的表達，FnbB 是 MSCRAMM 家族的多功能蛋白質[25，26]。有研究小組證明，FnbB 基因缺失的突變體菌株中BF的形成銳減[27]。AS 可能通過抑制FnbB 的表達而破壞BF。已有研究發現，AS 在體內實驗中證實其環糊精包合物可通過抑制環氧化酶（Cyclooxygenase-2，COX-2）、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）激活、凋亡蛋白表達及調控各類細胞因子（TNF-α、IL-6）來減少巨噬細胞中的免疫反應間接抑制細菌性炎癥，從而達到抗菌作用[20，21]。AS 與 FOX 的聯用既可能通過抑制BF 使抗生素更易于發揮抗菌作用，又可能從人體免疫方向AS 類似NF-κB 抑制劑的作用幫助人體減少因感染而引起的強烈免疫損傷。同時因細菌難以對作用于免疫系統的藥物產生抗藥性，這也很好的解決了細菌易耐藥的問題。

總之，本研究通過網絡藥理學預測和體外細菌實驗確認AS 聯合FOX 對抗MRSA 存在相加作用，其機制與兩藥聯合抑制MRSA 毒力因子有關。AS 單用對MRSA BF 存在明顯抑制作用，而FOX 無此作用，致使FOX 無法透膜對MRSA 發揮抑殺作用。在AS 聯用FOX時，對MRSA的作用均優于兩者單用的效果，減少抗生素使用劑量，提高了MRSA對藥物的敏感性，降低耐藥風險。故本研究為AS 及AS 聯合FOX 體內抗MRSA 感染研究奠定基礎，在進一步的研究中將通過動物體內實驗探索兩藥聯用的體內轉化過程及效應機制，為臨床上AS 聯合FOX 治療MRSA 感染及減輕MRSA 耐藥提供依據。本研究開辟了中西藥聯合作用治療感染性疾病的新思路和新方法。