冬蟲夏草產地土壤中耐砷細菌的分離、鑒定及耐砷能力測定＊

楊 俐 ，鄧陽川 ，蘇燕燕 ，葉 萌 ，向 麗 ＊＊

（1. 中國中醫科學院中藥研究所 中藥鑒定與安全性檢測評估重點實驗室 北京 100700；2. 四川農業大學林學院溫江 611130）

砷是自然界中普遍存在的一種類金屬元素，是一種有毒、有害物質，具有致癌性[1]。砷在土壤中以無機和有機兩種形式存在，主要以離子狀態存在，有三價砷As（Ⅲ）與五價砷As（Ⅴ）兩種價態，而As（Ⅲ）比As（Ⅴ）毒性高約100倍[2-4]。無機砷在動物、真菌、人體中代謝主要是還原和氧化甲基化，進入細胞內的五價無機砷被還原為三價無機砷，再進行甲基化代謝，形成多種含砷化合物，砷在體內的代謝產物是導致機體發生砷中毒的主要因素[5-8]。雖然砷對人體具有很大的毒性，但在長期的歷史演化過程中，一些微生物進化出了各種砷代謝機制，能夠抵抗高濃度的砷，甚至還能利用砷作為能源[9-11]。微生物的砷代謝機制主要有As（Ⅲ）化能有機異養型和無機自養型氧化、As（Ⅴ）細胞質還原和異化砷還原、As（Ⅲ）甲基化，根據微生物對砷的代謝機制不同將其分為砷氧化微生物、砷還原微生物和砷甲基化微生物[12-14]。砷氧化細菌能將As（Ⅲ）氧化為毒性較弱As（Ⅴ），砷甲基化細菌通常生成毒性較弱的有機砷產物，均能降低環境中砷毒性。砷還原細菌能將As（Ⅴ）還原為毒性更強的As（Ⅲ），As（III）更容易被植物或微生物吸收造成砷富集[5,15]。

冬蟲夏草為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌[Cordyceps sinensis(Berk.) Sacc.] 寄生在鱗翅目蝙蝠蛾科（Hepialidae）昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的干燥復合體，是我國傳統名貴中藥，冬蟲夏草與人參、鹿茸并列為我國“中藥三寶”[16-17]。野生冬蟲夏草普遍存在著重金屬砷含量超標的問題，總砷含量為2.12-15.51 mg·kg-1[18-20]。在前期研究中，野生冬蟲夏草子實體轉錄組數據庫內含有29 條與砷氧化細菌（Herminiimonas arsenicoxydans）染色體相似度較高的序列，其中25條的序列相似性為100%。但是在無菌條件下人工繁育的24批冬蟲夏草總砷含量為0.3-0.4 mg·kg-1[21]，遠低于《中華人民共和國藥典》、《藥用植物及制劑外經貿綠色行業標準》、《GB 2762-2012 食品安全國家標準食品中污染物限量》等幾個標準的最低限，在安全范圍內。冬蟲夏草分布的青藏高原地區土壤砷背景值較高，提供了砷源[22-23]，因此，推測土壤中的耐砷細菌和冬蟲夏草自身對砷的代謝是導致冬蟲夏草藥材砷超富集的主要原因。

本研究擬對冬蟲夏草五個主要產地土壤中的耐砷細菌進行分離、鑒定，篩選出一批耐砷細菌，探究菌株的氧化還原性和耐砷能力，為后續進行冬蟲夏草砷超富集機制研究奠定基礎。

1 材料

1.1 土壤樣品采集

在四川省阿壩藏族羌族自治州小金縣（石槽溝、邊槽溝），四川省甘孜藏族自治州康定市（雅家埂、汪家溝），西藏那曲市比如縣等共5個冬蟲夏草生長地采集土壤。采樣器在土壤表層3 cm 處用多點混樣的方法得到，放入封口袋密封。所有樣品做好標簽并于4 ℃冰箱儲存備用。

1.2 試劑及儀器

本研究的試劑及儀器包括：細菌基因組DNA 提取試劑盒購自天根生化科技北京有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；Fatty Acid Methyl Esters 購 自 Microbial ID 公 司 ；PCR 擴 增 儀 ：Eppendorf Mastercycler X50；氣相色譜儀：安捷倫（Agilent）6890N；超凈工作臺：北京昌平長城凈化設備有限公司；恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；API 20NE 購自 Bio merieux 公司；UV-2102 C 型紫外可見分光光度計：龍尼柯（上海）儀器有限公司。

2 方法

2.1 菌株分離純化

在CDM 培養基（1 L 體系：硫酸銨2.0 g；無水乙酸鈉2.0 g；酵母提取物0.5 g；胰蛋白胨1.0 g；葡萄糖0.2 g；固體培養基再加瓊脂粉15 g；pH=7.5±0.2）中分別加入砷酸鈉（As5+：10 mM）和亞砷酸鈉（As3+：2 mM），配成10 mmol·L-1砷酸鈉 CDM 培養基和 2 mmol·L-1亞砷酸鈉CDM 培養基。取土壤樣本1.0 g，分別加入上述液體培養基中，28℃，150 r·min-1培養 2-3 d 后，轉接 2 次。將第三次轉接的富集液按不同濃度梯度稀釋，涂布于含有相同濃度砷的對應固體培養基上，待1-2 d 長出菌落后，經過多次的平板劃線分離，得到多個菌的純培養，編號并保存菌種。

2.2 耐砷細菌的鑒定

2.2.1 形態及生理生化特征分析

從分離純化的11個菌株中，選擇兩個生長狀態較好的菌株進行形態及生理生化特征分析。將純化后的單一菌落培養48 h，記錄菌落形狀、顏色、大小、透明度、黏稠度、邊緣是否光滑以及表面是否有褶皺等特點，挑取菌落并將其稀釋、涂片、革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌落的形態及染色結果，進而對菌株進行初步鑒定。通過微生物脂肪酸快速鑒定系統（MIDI）和非腸道革蘭氏陰性桿菌鑒定系統（API 20NE）分析菌株生理生化特性。

2.2.2 菌株16S rRNA序列鑒定

28 ℃條件下，菌株在CDM 液體培養基中搖床培養至對數期，離心收集菌體，利用DNA 提取試劑盒提取目的菌株的基因組DNA，用細菌16S 基因通用27F（5?-AGA GTTTGATCCTGGCTCAG-3?）和 1492R（5?-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3?）引物，PCR 體系20μL：2×Mix 10 μL，ddH2O 7μL，Primer-F 1μL，Primer-R 1μL，菌液 1μL；PCR 擴增程序：94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 1min，38個循環；72℃ 10min；4℃，保存。反應結束后，取5 μL PCR 擴增產物上樣于1.5%瓊脂糖凝膠，120 V 電壓，200mA 電流，電泳25 min，檢測擴增效果。PCR 產物送北京擎科有限公司測序。測序結果通過在EzBioCloud（http://www.ezbiocloud.net/eztaxon）公共數據庫與已知模式菌進行比較。利用軟件MEGA 6.0 按鄰接方法（Neighbor-Joining，N-J）構建系統發育樹。

2.3 定性硝酸銀（AgNO3）染色實驗

本研究采用定性硝酸銀篩選法[24]，用濃度為1 mmol·L-1的 AgNO3溶液對菌株進行染色，利用 AgNO3與As(Ⅲ)和As(Ⅴ)發生顏色反應的原理，鑒定所得到的菌株是砷氧化或還原細菌。將菌株分別接種于As(Ⅲ)、As(Ⅴ)的 CDM 培養液中培養，對照組接種大腸桿菌，培養24h 后向培養液中滴加AgNO3溶液，觀察菌液顏色變化，每個處理重復三次。

2.4 砷耐受能力的測定

以相同接種量將菌株分別置于含亞砷酸鈉、砷酸鈉的CDM 培養液中培養，As (Ⅲ)濃度分別為8 mmol·L-1、12 mmol·L-1、16 mmol·L-1、20 mmol·L-1，As (Ⅴ)濃 度 分 別 為 20 mmol·L-1、35 mmol·L-1、40 mmol·L-1、70 mmol·L-1，28℃，150 r·min-1培養 24 h，用紫外可見光分光度計在600 nm 處測吸光度值OD 600，以砷濃度（mmol·L-1）為橫坐標，以吸光度值OD 600 為縱坐標，繪制菌株耐砷濃度圖，每個處理重復三次。

3 結果與分析

3.1 菌株分離

從5 個主產地中分離得到11 株菌株，其中砷酸鈉（As5+：10 mM）處理中共分離到5 株菌，亞砷酸鈉（As3+：2 mM）處理中共分離到6 株菌。采用16S rRNA進行初步鑒定后，11 個菌株主要屬于不動桿菌屬（Acinetobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus），其中不動桿菌屬占大多數。砷酸鈉（As5+：10 mM）處理的產地中分離的菌株是不動桿菌屬、芽孢桿菌屬，亞砷酸鈉（As3+：2 mM）處理的產地中主要分離到不動桿菌屬。從四川省小金縣和西藏那曲中各挑取一株優勢菌株，分別編號為XB和XNQ用于后續鑒定分析。

3.2 菌株鑒定

3.2.1 菌落形態特征

菌株XB 革蘭染色為陰性、桿狀，常單個、成對或成團存在，需氧。30℃培養24 h后菌落成米黃色，直徑為1 mm 左右，圓形，表面光滑，凸起。菌株XNQ 革蘭染色為陰性、桿狀，常單個、成對或成團存在，需氧。30℃培養24 h 后菌落成米黃色，直徑為1.5 mm 左右，圓形，表面光滑，凸起。因此，菌株XB 和XNQ 均為革蘭氏陰性菌，菌株XNQ單個菌落直徑較XB大，其他形態特征相同。菌株形態及革蘭氏染色見圖1。

3.2.2 生理生化特征

菌株XB 和XNQ 的主要脂肪酸類型相同，均為C18:1 ω9c、C16:0、Summed Feature 3 (C16:1 ω7c/C16:1 ω6c)和C12:0，菌株XB 主要脂肪酸含量分別為31.34 %、23.76 %、23.69 %、6.04 %，菌株XNQ 主要脂肪酸含量分別為40.03%、21.68%、16.06%和4.63%。API 20NE 檢測顯示，菌株XB 陽性反應有：阿拉伯糖、己二酸、蘋果酸、檸檬酸和苯乙酸，陰性反應有：硝酸鉀、色氨酸、葡萄糖、精氨酸、尿素、七葉靈、明膠、對硝基-D-甲基半乳糖、甘露糖、甘露醇、N-乙酰-葡萄糖胺、麥芽糖、葡萄糖酸鹽和癸酸。菌株XNQ 陽性反應有：阿拉伯糖、癸酸、己二酸、蘋果酸、檸檬酸和苯乙酸，陰性反應有：硝酸鉀、色氨酸、葡萄糖、精氨酸、尿素、七葉靈、明膠、對硝基-D-甲基半乳糖、甘露糖、甘露醇、N-乙酰-葡萄糖胺、麥芽糖和葡萄糖酸鹽。主要差異在于菌株XNQ能利用癸酸，而XB不能利用癸酸。見表1。

圖1 菌株的形態及革蘭氏染色圖

表1 菌株XB和XNQ的脂肪酸組成

續表

3.2.3 16S rRNA基因的序列分析

瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，2 株細菌均可擴增出約1400 bp 單一、清晰的序列條帶，擴增效果較好。雙向測序結果運用CodonCode Aligner V 7.0.1（CodonCode Co.,USA）進行測序峰圖的校對拼接。獲得的基因片段在EzBioCloud（http://www.ezbiocloud.net/eztaxon）公共數據庫中與已知模式菌進行比較。結果如表 2 所示，菌株 XB 獲得 16S 片段長 1431 bp，與已知種Acinetobacter guillouiae的序列 APOS01000028 相似性為99.72%，相差四個堿基。菌株XNQ 獲得的16S片段長1431 bp，與已知種Acinetobacter nosocomialis的序列APOP01000014 相似性為99.86%，相差兩個堿基。通過Mega 6.0 構建系統發育樹（見圖2），菌株XB 與A.guillouiae聚為一類，菌株XNQ與A.nosocomialis聚為一類。結合菌株形態特征、生理生化特性及16S rRNA序列來看，XB為A.guillouiae，XNQ為A.nosocomialis。

表2 菌株XB和XNQ的16 S序列比較分析結果

圖2 菌株XB、XNQ系統發育樹

3.3 菌株氧化還原性

AgNO3溶液與As（Ⅲ）反應生成淺黃色沉淀，與As（Ⅴ）反應生成淺棕色沉淀[24]。菌株培養24h 后，加入AgNO3溶液，菌株 XB 和 XNQ 的顏色變化如圖 3 所示。CK 組As（Ⅲ）培養液呈淺黃色，As（Ⅴ）培養液呈淺棕色，靜置一段時間后，離心管底部會析出對應顏色的沉淀。XNQ、XB 菌液在As（Ⅲ）培養液中顯黃色，說明培養液中仍然是As（Ⅲ），菌株不具有砷氧化性。XNQ、XB 菌液在 As（Ⅴ）培養液中也顯黃色，可知XNQ、XB 菌株將As（Ⅴ）還原成As（Ⅲ），具有砷還原性，均是As（Ⅴ）還原細菌。

3.4 砷耐受能力測定結果

接種后測定菌液初始OD 600 約為0.05，隨著As（Ⅲ）、As（Ⅴ）濃度升高，菌株的OD 600越來越小，砷對菌株的抑制作用越大（見圖4）。隨著砷濃度的增加，菌株的生長繁殖速率下降。兩種菌對As（Ⅲ）的耐受性相同，當As（Ⅲ）的濃度達到20 mmol·L-1時，菌株不再生長，對As（Ⅴ）耐受性也相同，當As（Ⅴ）濃度達到70 mmol·L-1，菌株不再生長。菌株對 As(Ⅴ)的耐受性略高于As（Ⅲ），這可能是由于XB 和XNQ 都是As（Ⅴ）還原細菌，且As（Ⅲ）毒性遠遠大于As（Ⅴ）。無論是As（Ⅲ）還是As（Ⅴ）培養液中，當砷離子濃度相同時，培養液中菌株XB 的細菌數量多于菌株XNQ，說明XB菌株對砷的耐受性略強于XNQ菌株。

4 討論

從冬蟲夏草五個主要產地土壤中分離純化了一批耐砷細菌，共篩選出11 株菌株，分屬不動桿菌屬和芽孢桿菌屬兩個屬，相比其他研究者從其他環境中分離出的耐砷菌株的種類較少，可能是產地地理環境差異造成的[25]。對四川省小金縣石槽溝和西藏那曲市比如縣的兩株菌進行了形態、生理生化、16S rRNA 分析，鑒定結果分別為不動桿菌屬A. guillouiae和A.nosocomialis。已有研究發現，A.guillouiae能降解苯酚，能抑制銅綠微囊藻的生長，降低微囊藻素合成，能耐受高濃度NaCl 和多種重金屬離子[26-28]，A.nosocomialis是近年來最常出現的可引起嚴重人類疾病的醫院獲得感染條件致病菌[29]，但有關兩種菌對重金屬砷的耐受性的研究較缺乏。

圖3 硝酸銀（AgNO3）溶液染色結果

圖4 菌株對砷的耐受性

本研究得到兩種菌株對As（Ⅲ）、As（Ⅴ）的耐受性相 同 ，分別為 20 mmol·L-1、70 mmol·L-1。 Vivian Hsiu-Chuan Liao 等[30]從高砷污染水中分離10種兼性厭氧砷酸鹽還原菌，對As（Ⅴ）耐受性最高達到800 mmol·L-1，Sangeeta Shakya 等[31]發現史密斯芽孢桿菌（Bacillus smithii）能耐 1000 mg·L-1的砷酸鹽和 749 mg·L-1的亞砷酸鹽，吳丹等[32]發現假單胞菌屬、蒼白桿菌屬、芽孢桿菌屬、威廉氏菌屬和節細菌屬中的6 株細菌對As（Ⅴ）和 As（Ⅲ）的耐受性值分別高達 800 mmol·L-1和 20 mmol·L-1。由此可見，相對于已發現的其他菌株，研究分離的A.guillouiae和A.nosocomialis的耐砷能力不是特別高，但對As（Ⅴ）和As（Ⅲ）的耐受能力均表現出相同的趨勢，即對As（Ⅴ）的耐受能力高于As（Ⅲ）。

細菌在對高砷環境長期的適宜中，進化出砷轉化機制以抵抗不利環境，一般有As（Ⅲ）的氧化、As（Ⅴ）的還原、砷的甲基化三種[33]。已有研究表明，一些土壤中的耐砷細菌可以通過砷轉化機制促進植物生長，同時使植物體內砷含量增加[34-35]。本研究發現的兩種菌都是As（Ⅴ）還原細菌，能將As（V）還原為毒性更強的As（III），然后利用亞砷酸鹽特異性轉運蛋白arsB 將As（III）排出體外，從而降低細胞內毒性[36]。研究發現，砷在冬蟲夏草中主要以無毒的有機砷形式存在；有毒的無機砷僅占8.69%，且主要集中在蟲體中，多以亞砷酸鹽、砷酸鹽形式存在；子座中As（V）含量大于As（III），蟲體中As（III）大于As（V）[19,37]。金鵬飛等[38]發現，冬蟲夏草對砷是具有一定的甲基化代謝功能的。根據實驗結果可以推測，耐砷細菌對冬蟲夏草砷富集可能有一定的促進作用，砷還原細菌將土壤中As（V）還原為As（III），能促進冬蟲夏草對As（III）的吸收，冬蟲夏草菌通過對As（III）進行甲基化，將As（III）轉化為甲基胂酸，并進一步代謝為各種含砷化合物，導致冬蟲夏草內砷含量增加。

因此，在未來有必要深入研究耐砷細菌、冬蟲夏草自身砷代謝途徑與冬蟲夏草砷富集之間的關系，通過實驗數據解釋冬蟲夏草砷超富集機制。土壤中細菌種類繁多，本研究從冬蟲夏草產地土壤中篩選出的耐砷細菌種類較單一，僅對其中兩株作了詳細鑒定分析，均為砷還原細菌，后續還需對其他的菌株進一步進行鑒定分析，測定氧化還原性，為研究耐砷細菌對冬蟲夏草砷超富集機制試驗提供科學依據。