胃腺癌中WWOX和ABCG2的表達及其臨床意義

田 靜，李學敏，吳莉莉，代 群，張 湛

2018年全球新增胃癌患者約100萬人，死亡約78.3萬人[1]，其中中國至少有一半的新發胃癌患者和死亡病例[2]。胃腺癌約占胃癌總數的90%[3]。WW結構域氧化還原酶(WW domain-containing oxidoreductase, WWOX)最初是在乳腺癌中發現的抑癌基因。WWOX基因的突變方式主要為半合子和純合子缺失[4]，導致其表達異常降低，與腫瘤組織的浸潤、轉移及復發等密切相關[5-6]。腫瘤干細胞(cancer stem cells, CSC)是指一小群具有自我更新、不對稱分裂及誘導分化、侵襲、轉移及抵抗放、化療的細胞[7]。三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白G亞家族成員2(ATP-binding cassette sub-family G member 2, ABCG2)是三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白家族重要成員，可以促進CSC的側群細胞形成[8]。目前，關于WWOX和ABCG2的關系尚未見報道。本文主要通過免疫組化EnVision法檢測112例胃腺癌組織中WWOX和ABCG2蛋白的表達，分析其與胃腺癌的浸潤、轉移及預后的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2010年1月～2018年12月合肥第三人民醫院病理科和肥西縣人民醫院病理科胃腺癌組織標本112例(術前未行任何抗腫瘤治療)和相應的癌旁(>5.0 cm)正常胃黏膜組織60例作為對照。所有胃腺癌患者均有完善的臨床病理資料和隨訪資料，入選病例隨訪至患者死亡或截止2019年3月。隨訪時間4～83個月，中位時間為49.1個月。年齡28～75歲，中位年齡55.3歲。

1.2 試劑兔抗人多克隆抗體WWOX和鼠抗人單克隆抗體ABCG2，均購自美國Abcam生物公司；EnVision和DAB顯色試劑盒，均購自北京中杉金橋公司。

1.3 方法標本均經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，連續4 μm厚切片，在二甲苯及梯度乙醇溶液中連續脫蠟至水洗。WWOX和ABCG2蛋白的染色步驟按試劑盒說明書進行，用已知陽性片作陽性對照，采用PBS液代替一抗作空白對照。

1.4 結果判定WWOX主要以細胞質內呈黃色或棕黃色顆粒為陽性，細胞膜也可以著色；ABCG2主要以細胞膜和細胞質內呈黃色或棕黃色顆粒為陽性。陽性判定主要根據免疫組化染色的著色強度和陽性細胞百分數乘積計分[9]，若乘積≥3分判定為陽性，<3分判定為陰性。免疫組化染色結果判定由兩位高年資病理醫師通過雙盲法獨立閱片。

1.5 統計學分析數據經SPSS 20.0軟件進行統計學分析。WWOX和ABCG2蛋白表達與胃腺癌中臨床病理參數及相關性采用χ2、Spearman等級相關檢驗；應用Kaplan-Meier法分析WWOX和ABCG2陽性組和陰性組患者術后總生存時間，組間比較采用Log-rank法檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃腺癌中WWOX蛋白表達WWOX蛋白在對照組中的陽性率為91.7%(55/60)，在胃腺癌組中的陽性率為42.0%(47/112)，WWOX蛋白的表達差異在兩組之間有統計學意義(P<0.001，圖1A、B)。進一步分析發現，隨著胃腺癌組織的分化越差、TNM分期越高，WWOX蛋白的陽性率越低，差異有統計學意義(P<0.05)；淋巴結轉移組中WWOX的陽性率顯著低于淋巴結無轉移組。WWOX蛋白的表達與胃腺癌患者年齡、腫瘤位置、大體類型、大小及吸煙和飲酒，差異均無統計學意義(P>0.05，表1)。

2.2 胃腺癌中ABCG2蛋白的表達ABCG2蛋白在對照組中的陽性率為8.3%(5/60)，在胃腺癌組中的陽性率為59.8%(67/112)，兩者差異有統計學意義(P<0.05，圖1C、D)。ABCG2蛋白表達與胃腺癌患者性別、年齡、腫瘤位置、大體類型、大小及吸煙和飲酒，差異均無統計學意義(P>0.05，表1)。隨著胃腺癌組織的分化越差，ABCG2蛋白的陽性率越高，差異均有統計學意義；淋巴結轉移組中ABCG2蛋白的陽性率顯著高于淋巴結無轉移組；TNM高分期組中的ABCG2蛋白的陽性率顯著高于TNM低分期組，差異均有統計學意義(P<0.05，表1)。

圖1 A. WWOX在對照組中呈陽性，EnVision法；B. WWOX在胃腺癌中呈陰性，EnVision法；C. ABCG2在對照組中呈陰性，EnVision法；D.ABCG2在胃腺癌中呈陽性，EnVision法

2.3 WWOX和ABCG2蛋白表達的相關性Spearman等級相關分析顯示，在胃腺癌組中WWOX與ABCG2蛋白的表達呈負相關(r=-0.558，P<0.001，表2)。

2.4 Cox多因素回歸分析將胃腺癌患者性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤位置、大體類型、分化程度、淋巴結轉移、TNM分期、WWOX、ABCG2、吸煙以及飲酒等因素，經Cox多因素回歸模型分析：WWOX和ABCG2蛋白的表達及TNM分期是影響胃腺癌患者術后生存時間的獨立預后因素(表3)。

2.5 生存分析本組經Kaplan-Meier生存分析顯示，WWOX蛋白陽性組與陰性組的中位生存時間分別為(66.2±16.4)個月和(36.7±18.9)個月，Log-rank分析兩組總生存時間差異有統計學意義(P<0.001，圖2A)；ABCG2蛋白陽性組與陰性組患者的中位生存時間分別為(67.4±15.0)個月和(36.8±18.9)個月。Log-rank分析兩組總生存時間差異有統計學意義(P<0.001，圖2B)。

表1 WWOX和ABCG2蛋白表達與胃腺癌臨床病理特征的關系

表2 WWOX和ABCG2蛋白表達的相關性

表3 胃腺癌患者的多因素分析

圖2 胃腺癌患者生存曲線: A.WWOX表達與胃腺癌患者預后的關系；B.ABCG2表達與胃腺癌患者預后的關系

3 討論

盡管各種新的治療手段(如靶向治療、免疫治療等)在一定程度改善胃腺癌患者的預后，但胃腺癌患者術后總生存時間并未顯著延長。因此，需尋找能夠預測胃腺癌患者浸潤、轉移和預后的標志物。抑癌基因的表達異常降低或缺失是腫瘤發生、發展中的關鍵環節。WWOX又叫脆性位點FRA16D氧化還原酶，是近年才發現的抑癌基因。WWOX基因定位于人染色體16q23.3-24.1，含有9個外顯子和8個內含子，編碼長度為414個氨基酸殘基的蛋白質。眾多的研究表明，WWOX基因可以抑制腫瘤細胞的增殖、浸潤、轉移以及促進凋亡[10-11]。WWOX在正常組織中廣泛表達，其在多種腫瘤組織中主要表現為半盒子和純合子缺失，導致其表達降低或缺失。本組采用免疫組化EnVision法檢測WWOX蛋白在胃腺癌組及對照組中的表達，發現在胃腺癌組中WWOX蛋白的陽性率顯著低于其在對照組中的陽性率，差異有統計學意義。進一步分析發現，隨著胃腺癌分化越差，WWOX蛋白陽性率越低，差異有統計學意義；淋巴結轉移組中WWOX蛋白的陽性率也顯著低于無淋巴結轉移組中的陽性率；TNM分期越高，WWOX蛋白的陽性率也越低，差異均有統計學意義。上述結果表明，WWOX蛋白表達的異常降低或缺失可能促進胃腺癌的增殖、浸潤及轉移，該結果與其他學者的研究結果一致[4-6,12]。

ABCG2是ABC轉運蛋白家族重要成員之一，該家族成員屬于跨膜蛋白，最先在乳腺癌細胞株MCF-7中發現，能夠抵抗部分化療藥物的抗腫瘤作用，主要通過其位于細胞膜上的泵將細胞內的抗癌藥物轉運到細胞外。ABCG2能通過泵將腫瘤細胞內的藥物主動轉運到細胞外，從而促進腫瘤細胞多藥耐藥的形成[13]。眾多研究表明，ABCG2表達異常增高，常常意味著腫瘤患者術后易于復發、轉移，且預后較差[14]。2012年有學者發現ABCG2表達增強能夠促進CSC中的SP細胞形成，隨后在多種腫瘤組織中發現相似作用，因此認為ABCG2是一個新的CSC標志物。本實驗發現ABCG2蛋白在胃腺癌陽性率顯著高于其在對照組中的陽性率，差異有統計學意義。進一步分析發現，隨著胃腺癌組織分化越差，ABCG2蛋白的陽性率越高，差異有統計學意義；淋巴結轉移組中ABCG2蛋白的陽性率也顯著高于無淋巴結轉移組中的陽性率；TNM分期越高，ABCG2蛋白的陽性率也越高，差異均有統計學意義。上述結果表明，ABCG2蛋白表達的異常增高可能參與胃腺癌的發展、浸潤及轉移等過程，與其他學者的研究結果一致[7-10]。

目前，根據患者TNM分期制定治療策略的原則已被廣泛接受，但是由于腫瘤的異質性和演進，TNM分期難以完全反應每個腫瘤患者的具體生物學特性。因此，迫切需要找到能夠預測每個腫瘤的生物學行為的標記。ABCG2蛋白陽性組患者術后總生存時間明顯低于其陰性組；WWOX蛋白陽性組患者的術后總生存時間明顯高于其陰性組，Log-rank分析表明差異均有統計學意義。多因素分析表明WWOX和ABCG2蛋白陽性以及TNM分期是影響胃腺癌患者術后生存的獨立預后因素。Spearman相關分析顯示WWOX和ABCG2蛋白的表達呈負相關，差異均有統計學意義。于小棠等[15]通過質粒轉染增強WWOX的表達，發現WWOX能夠抑制CSC的干性，包括自我更新能力、分化潛能、體內致瘤能力、干細胞基因的高水平表達和多藥耐藥性。Li等[16]通過基因沉默技術降低WWOX的表達，發現WWOX可能通過Hippo、MAPK以及TGF-β等信號通路調節CSC的干性。表達異常增高的ABCG2可能參與胃腺癌的發生，并進一步促進胃腺癌細胞的增殖、浸潤和轉移。與此同時，表達降低或缺失的WWOX蛋白喪失其抑制CSC的自我更新及誘導腫瘤細胞分化的能力[13,15]，進一步促進胃腺癌細胞的增殖、浸潤和轉移，且ABCG2高表達和WWOX的低表達提示患者預后差。

綜上所述，異常表達的ABCG2蛋白參與胃腺癌發生，可能與表達降低的WWOX協同促進胃腺癌的增殖、浸潤及轉移等過程。因此，在胃腺癌患者腫瘤組織中早期聯合檢測ABCG2和WWOX蛋白的表達，可作為預測胃腺癌患者術后浸潤、轉移及預后的候選指標之一。