乙型肝炎患者治療過程中血清USP7、IL-6、TNF-a的動態(tài)變化及相關性研究

馬玉 張咪 王雪

摘要 目的：初步探討泛素特異性蛋白酶7（Ubiquitin-specific proteases7，USP7）、白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor α，TNF-α）在乙型肝炎患者血清中的動態(tài)表達及其與肝功指標的相關性。方法：收集不同時間點乙型肝炎患者的血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測98例乙型肝炎患者入院治療前和治療1w、2w、3w、4w血清中USP7、IL-6、TNF-α的表達水平，并分析USP7及炎癥因子與肝功指標的相關性。結果：USP7在乙型肝炎患者治療過程中呈現(xiàn)規(guī)律變化，并且隨著治療時間的延長，蛋白表達水平逐漸下降，且治療1w、2w、3w、4w后血清USP7、IL-6、TNF-α與治療前相比差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。USP7蛋白表達量與IL-6、TNF-a的表達呈正相關（P<0.05）。結論：USP7可能參與乙型肝炎的發(fā)展進程，并且與乙型肝炎病毒感染導致的肝臟炎性損傷有一定聯(lián)系。

關鍵詞 USP7;乙型肝炎;炎癥

中圖分類號? R512.62? ? 文獻標識碼? B? ? 文章編號? 1671-0223（2020）02-029-04

Abstract? ?Objective To survey the dynamic changes of USP7， IL-6 and TNF-α in serum of patients with hepatitis B and its correlation with ALT and AST. Methods The expression of USP7，IL-6，TNF-α detected by ELISA and liver function indicators correlation. Results USP7 showed regular changes during the treatment of hepatitis B patients， and with the prolongation of treatment time， the protein expression level gradually decreased， and serum USP7， IL-6， TNF-α， ALT， AST， etc. after 1w， 2w， 3w， 4w treatment There were significant differences between the two groups （P <0.05）. The expression of USP7 protein was positively correlated with the protein expression of ALT， AST and IL-6， TNF-α （P <0.05）. Conclusion USP7 may be Participate in the development of hepatitis B and have a certain relationship with liver inflammatory damage caused by hepatitis B virus infection.

Key words USP7; Hepatitis B; Inflammation

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）引起的以肝臟慢性炎性損傷為主的傳染病[1，2]。目前，HBV已呈世界性大流行，我國是HBV感染高發(fā)區(qū)，其慢性炎癥引起的肝炎后肝硬化、乙型肝炎相關肝癌更是不容小覷[3]。因此，有效的監(jiān)測乙型肝炎的發(fā)展并及時給予干預措施顯得尤為重要。

近年來，在肝病的機制研究中，表觀遺傳因素受到了越來越多的關注。其中，蛋白的泛素化、去泛素化是表觀遺傳的重要組成部分，且在肝病發(fā)生過程中發(fā)揮著十分重要的作用[4，5]。這為乙型肝炎的研究提供了新的視角。泛素特異性蛋白酶（USPs）是構成去泛素化酶的最大亞家族，它是從特定蛋白質底物中去除泛素，以防止它們被靶向蛋白酶體降解的一種去泛素化酶[4，5]。作為USP家族的一員，USP7（與皰疹病毒相關的USP，HAUSP）是一種進化上保守的蛋白，最初被認為是單純皰疹病毒蛋白Vmw110的結合配偶體，同時也為細胞生長控制，細胞周期調控，受體功能，發(fā)育和應激反應所必需[6]。近期有研究表明，USP7在HBV相關肝癌中呈現(xiàn)高表達[7]，還有研究表明，USP7與炎癥信號通路NF-κB相互作用[5]且NF-κB可以調控多種炎癥因子，而在HBV感染狀態(tài)下，T細胞是清除細胞內病毒最主要的效應細胞。T細胞可產生多種細胞因子，如：IL-6、TNF-a等，在HBV的免疫應答中起核心作用。因此，我們推測，USP7在乙型肝炎的進程中起著一定的作用。

本研究對乙型肝炎患者治療不同階段的血清USP7及炎癥相關因子進行動態(tài)監(jiān)測，以期為預防HBV導致的肝損傷進一步惡化提供證據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2018年8月-2018年12月在石家莊市第五醫(yī)院被診斷為乙型肝炎的住院患者作為觀察對象，共98例，其中男性71例，女性27例。入組患者的臨床資料及肝功指標由石家莊市第五醫(yī)院檢查記錄或問卷調查獲得。所有患者均簽訂知情同意書。

1.2 納入排除標準[8]

納入標準：符合中華醫(yī)學會肝病學分會制定的《慢性乙型肝炎防治指南》（2015版）診斷標準。

排除標準：孕產婦;除HBV外的其他病毒感染者;合并其他類型肝病的患者;合并嚴重代謝性、免疫性疾病;近1個月內有輸血史者等[8]。

1.3 問卷調查[8]

收集研究對象的一般資料（性別、年齡、民族、吸煙、飲酒等）抗病毒治療方案、個人病史及用藥史等。

1.4 血標本處理[8]

收集每個納入患者入院治療前第一份靜脈血1.5mL，治療1w、2w、3w、4w后靜脈血1.5mL，12000rpm離心5min，取上清于EP管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 ELISA法檢測USP7及IL-6、TNF-α的蛋白表達水平[8]

試劑盒由北京安迪華泰科技有限公司提供，試劑盒室溫平衡20 min后取出板條，設置標準孔和樣本孔，標準孔加不同濃度標準品各50 μL，樣本孔加細胞上清液10 μL同時加入40 μL樣本稀釋液，各孔加入辣根過氧化物酶（HRP），封板膜封住，37 ℃溫育后，洗板5次，每孔加入底物A、B，37 ℃溫育后，加終止液，酶標儀檢測OD值，最后通過標準曲線方程計算蛋白含量。

1.6 統(tǒng)計分析

采用SPSS23.0進行數(shù)據處理，非正態(tài)分布計量資料（USP7、IL-6、TNF-α等）用“中位數(shù)（四分位間距）”進行統(tǒng)計描述，組間中位數(shù)比較采用非參數(shù)檢驗;各指標間的相關性采用spearman相關分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 研究對象臨床資料

98例研究對象的性別、年齡等臨床特征見表1。

2.2 乙型肝炎患者血清中USP7、IL-6、TNF-a蛋白表達變化

結果顯示，隨著治療周期的延長，USP7、IL-6、TNF-α的蛋白表達水平也逐漸降低，且治療1w、2w、3w、4w與治療前相比，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。提示，USP7可能參與了HBV導致的炎癥反應。見圖1、圖2。

2.3 USP7與IL-6、TNF-a、ALT、AST的相關性分析

結果顯示，乙型肝炎患者血清USP7蛋白表達量與ALT、AST及IL-6、TNF-a的蛋白表達量均呈正相關（P<0.05）。提示，USP7可能參與調控HBV導致的肝臟炎性損傷。見表2。

3 討論

中國甲乙類法定報告?zhèn)魅静≈校倚透窝椎陌l(fā)病率和死亡率均位列前三，不容小覷。乙型肝炎病毒（HBV）是一種肝嗜酸病毒，可通過免疫反應性在人類體內建立持久性和慢性感染[8]。目前，HBV感染導致乙型肝炎的發(fā)病機制尚未明確，有研究指出HBV是通過誘導機體免疫反應，產生多種炎癥因子，從而導致肝臟炎癥性表現(xiàn)[9，10]。因此，對乙型肝炎病程及其肝損傷的程度進行有效監(jiān)測，闡明其機制并找到靈敏的監(jiān)測指標對乙型肝炎的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。

USP7作為泛素特異性蛋白酶家族中的一員，有研究指出，它不僅作用于癌蛋白與抑癌蛋白，還可與病毒相關蛋白相互作用[11]。而乙型肝炎又是HBV病毒感染導致的傳染性疾病，推測，USP7在乙型肝炎中起調控作用，因此，本研究對USP7進行動態(tài)監(jiān)測，結果顯示，USP7的表達是隨著乙型肝炎治療而逐漸降低的，且USP7與ALT、AST的表達呈正相關，提示，USP7與HBV感染導致的肝損傷有關，并可能參與了乙型肝炎的進展。

TNF-α作為重要的炎癥介質，在HBV病毒感染時可促進T細胞產生大量炎癥因子，使肝細胞的氧化應激反應增強[12]。IL-6作為多功能細胞因子，可直接參與肝臟炎癥反應和損傷過程[13]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6可通過多種信號通路，調控腫瘤細胞周期和基因表達[14]。HBV感染后炎性損傷最易出現(xiàn)，且最常見的異常表現(xiàn)是血清轉氨酶升高。臨床上，反應乙型肝炎肝臟損傷的實驗室檢查指標為ALT、AST，且與用藥直接相關。因此，本研究對TNF-α、IL-6等促炎因子以及肝損傷指標ALT、AST進行監(jiān)測，用以觀察肝臟炎性損傷情況，本研究結果顯示，隨著治療周期的延長TNF-α、IL-6的表達呈下降趨勢，并且與剛入院未治療前相比，TNF-α、IL-6表達水平明顯降低，并與肝功指標ALT、AST變化趨勢一致，提示肝臟炎癥損傷減輕;通過相關性分析發(fā)現(xiàn)去泛素化酶USP7蛋白表達與IL-6、TNF-α表達均成正相關，提示，USP7可能參與調控乙型肝炎炎癥反應，有研究表明，USP7與炎癥信號通路NF-κB相互作用[15，16]。同時，有研究也顯示USP7與病毒蛋白也能發(fā)生相互作用[11]，因此，推測，在本研究中USP7可能是通過去泛素化NF-κB在HBV誘導的肝臟炎癥反應中起作用的，也可能是通過與病毒蛋白相互作用在乙型肝炎炎癥損傷中發(fā)揮功能的。這還需要進一步通過體內體外實驗進行深入探究。

綜上，USP7可能參與了乙型肝炎的發(fā)展進程，其具體機制尚不明確，本課題組將繼續(xù)通過體內、體外等實驗探究去泛素化酶USP7調控炎癥的作用機制，以期為臨床上早發(fā)現(xiàn)、診斷和治療HBV感染引起的肝臟炎性損傷提供新思路。

參考文獻

[1] 曾田英. 慢性乙肝、肝硬化患者CXCL6及其受體CXCR1、CXCR2的表達[D].淮南：安徽理工大學，2013.

[2] Tang L， Covert E， Wilson E， Kottilil S. Chronic Hepatitis B Infection： A Review[J]. JAMA. 2018. 319（17）： 1802.

[3] 賀小琴， 宋孝美， 郭進軍. 乙肝病毒感染與乙肝相關肝癌疾病發(fā)展的綜述[J]. 科學咨詢（科技·管理）. 2018. 4（14）：53-54.

[4] Reyesturcu FE， Ventii KH， Wilkinson KD. Regulation and cellular roles of ubiquitin-specific deubiquitinating enzymes. Annu Rev Biochem. 2009. 78（1）： 363-397.

[5] 姚閃，陳松，葉茂.去泛素化酶USP7在細胞中的功能作用及其研究進展[J].激光生物學報，2014，23（01）：9-15.

[6] Meulmeester E， Maurice MM， Boutell C， et al. Loss of HAUSP-mediated deubiquitination contributes to DNA damage-induced destabilization of Hdmx and Hdm2. Mol Cell. 2005. 19（1）： 143-144.

[7] 吳勝強. USP7在HBV相關肝癌中高表達并提示患者不良預后[J].世界最新醫(yī)學信息文摘，2018，18（99）：3-7.

[8] 王悅. 乙型病毒性肝炎患者血漿中相關非編碼RNA的動態(tài)表達及其意義[D].唐山：華北理工大學，2017.

[9] Boeijen LL， Hoogeveen RC， Boonstra A， Lauer GM. Hepatitis B virus infection and the immune response： The big questions. Best Practice & Research Clinical Gastroenterology. 2017. 31（3）： S1521691817300410.

[10] 王鵬，鄭吉順，梁利民.CXCL-13與IL-1β、IL-6在慢性乙型病毒性肝炎患者中表達的臨床意義[J].河北醫(yī)藥，2018，40（13）：2018-2020.

[11] Xie Y. Hepatitis B Virus-Associated Hepatocellular Carcinoma. Oxygen Transport to Tissue XXXIII. 2017 ： 11-21.

[12] 張超， 姜斌， 高豐厚. 去泛素化酶-USP7通過影響相關癌蛋白參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2016. 24（22）： 3684-3687.

[13] Baryehuda S， Stemmer SM， Madi L， et al. The A3 adenosine receptor agonist CF102 induces apoptosis of hepatocellular carcinoma via de-regulation of the Wnt and NF-kappaB signal transduction pathways. Int J Oncol. 2008. 33（2）： 287-295.

[14] Giannoudis PV， Harwood PJ， Loughenbury P， Van GM， Krettek C， Pape HC. Correlation between IL-6 levels and the systemic inflammatory response score： can an IL-6 cutoff predict a SIRS state[J]. Journal of Trauma. 2008. 65（3）： 646-652.

[15] 劉徽， 朱波， 林治華. IL-6信號通路與腫瘤[J]. 細胞與分子免疫學雜志. 2011， 27（3）： 353-355.

[16] 陳雨晗，張令強，賀福初.去泛素化酶與基因表達調控[J].生物化學與生物物理進展，2014，41（02）：126-138.

[2020-01-07收稿]