早期異位妊娠母體血清Netrin-1檢測的意義分析

周高紅 朱偉英 鐘少平

【摘要】 目的 探討早期異位妊娠母體血清Netrin-1檢測的臨床意義。方法 選取擬診早期異位妊娠患者100例作為實驗組， 另選取同期要求終止妊娠的宮內早孕患者100例作為對照組。采用酶聯免疫吸附劑測定（ELISA）試劑檢測兩組患者母體血清Netrin-1表達水平。比較兩組患者Netrin-1表達水平， 分析Netrin-1診斷早期異位妊娠臨床診斷閾值。結果 實驗組患者Netrin-1表達水平為（80.84±8.66）pg/ml， 顯著低于對照組的（353.00±9.96）pg/ml， 差異有統計學意義（P<0.05）。Netrin-1濃度診斷早期異位妊娠的受試者工作特征曲線（ROC）曲線下面積的95%可信區間為（0.911， 0.977）。據Youdens index計算Netrin-1臨床診斷閾值為226.50 pg /ml， 即Netrin-1濃度≤226.50 pg /ml考慮早期異位妊娠可能性大。結論 早期異位妊娠患者血清Netrin-1表達顯著降低， 考慮可能與異位妊娠患者絨毛血管形成受阻有關。

【關鍵詞】 Netrin-1;早期異位妊娠;血清

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.08.087

【Abstract】 Objective? ?To investigate the significance of Netrin-1 detection in maternal serum of early ectopic pregnancy. Methods? ?There were 100 cases of early ectopic pregnancy selected as the experimental group and another 100 cases of early intrauterine pregnancy requiring termination of pregnancy as the control group. The expression of Netrin-1 in maternal serum of the two groups was detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The expression level of Netrin-1 was compared between the two groups， and the clinical diagnostic threshold of Netrin-1 in the diagnosis of early ectopic pregnancy was analyzed. Results? ?The expression level of Netrin-1 in the experimental group was （80.84±8.66） pg/ml， which was significantly lower than （353.00±9.96） pg/ml in the control group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The 95% confidence interval of the area under the receiver operating characteristic （ROC） curve for subjects with Netrin-1 concentration in the diagnosis of early ectopic pregnancy was （0.911， 0.977）. According to Youdens index， the clinical diagnosis threshold of Netrin-1 was 226.50 pg/ml， that was， the concentration of Netrin-1?≤226.50 pg/ml was very likely to consider early ectopic pregnancy. Conclusion? ?The expression of Netrin-1 in serum of patients with early ectopic pregnancy was significantly decreased， which may be related to the obstruction of villous angiogenesis in patients with ectopic pregnancy.

【Key words】 Netrin-1; Early ectopic pregnancy; Serum

隨著社會的發展， 不孕癥患者日益增多， 相應導致輔助生殖技術的應用亦相應增多， 從而異位妊娠發生率相應升高。此外， 由于目前二胎政策的放開， 保留生殖能力日益引起人們的重視， 早期異位妊娠（ectopie pregnancy）（孕4～5周）保守治療治愈率高， 再生育率增加。因此目前早期異位妊娠的確診尤顯重要。由于早期異位妊娠臨床表現不明顯， 診斷較困難， 在診斷不明的情況下是繼續維持先兆流產的保胎方案， 還是采用異位妊娠的診療措施， 臨床工作中存在較大爭議， 從而導致異位妊娠患者終止妊娠時孕周偏大， 使得臨床上保守治療效果減弱。在胚泡著床過程中， 滋養細胞會產生一定相關血管新生因子維持妊娠[1]。Netrin-1作為一種血管新生因子， 可調節胚胎生長發育。在早期絨毛血管生成和早期胚胎停止發育的發病中Netrin-1家族成員可能也起到一定的作用[2]。據此， 本研究擬通過獲取患者孕早期血清Netrin-1水平確定早期異位妊娠， 從而提高保守治療效果， 提高患者再生育率?，F報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選擇2016年5月～2018年5月就診于本院婦科門診的擬診早期異位妊娠患者100例作為實驗組， 另選擇同期要求終止妊娠的宮內早孕患者100例作為對照組。本實驗經本院倫理委員會批準， 所有患者均簽署知情同意書。納入標準：此次妊娠前月經周期規律， 末次月經準確， 無內分泌及腫瘤病史， 妊娠后未服用影響胎兒發育的藥物， 無遺傳疾病， 慢性疾病及傳染病的健康女性;排除標準：妊娠前及妊娠期有寵物接觸史， 孕母有吸煙、酗酒及吸毒史， 多胎妊娠。兩組患者一般資料比較差異無統計學意義（P>0.05）， 具有可比性。見表1。

1. 2 標本的采集與制備 所有患者入組后抽取母體血檢測Netrin-1水平， 離心后血清留置于-80℃冰箱中， 待標本收集至少至20份后進行檢測， 所有血清標本均在3個月內檢測完畢， 其中Netrin-1水平ELISA試劑采用Human netrin-1 （Ntn1）ELISA Kit （CUSABIO， 美國）， 檢測儀器采用雷杜 Rayto 酶標儀檢測。按照常規ELISA試劑檢測步驟進行檢測。ELISA試劑盒操作步驟：實驗開始前， 提前配置好所有試劑， 試劑或樣品稀釋時均需混勻， 混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時用樣品稀釋液進行稀釋， 以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。①加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00 μl， 余孔分別加標準品或待測樣品100 μl， 注意不要有氣泡， 加樣將樣品加于酶標板孔底部， 盡量不觸及孔壁， 輕輕晃動混勻， 酶標板加上蓋或覆膜， 37℃反應120 min。②棄去液體， 甩干， 不用洗滌。每孔加生物素標記抗體工作液 100 μl（取1 μl生物素標記抗體加99 μl生物素標記抗體稀釋液的比例配制， 輕輕混勻， 在使用前1 h內配制）， 37℃， 60 min。③溫育60 min后棄去孔內液體， 甩干， 洗板3次， 浸泡1～2 min/次，?350 μl/孔， 甩干。④每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液（同生物素標記抗體工作液） 100 μl， 37℃， 60 min。⑤溫育60 min后棄去孔內液體， 甩干， 洗板5次， 浸泡1～2 min/次， 350 μl/孔， 甩干。⑥依序每孔加底物溶液90 μl， 37℃避光顯色。⑦依序每孔加終止溶液50 μl， 終止反應（此時藍色立轉黃色）。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性， 底物反應時間到后應盡快加入終止液。⑧用酶聯儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后15 min以內進行檢測。

1. 3 觀察指標 比較兩組患者Netrin-1表達水平， 分析Netrin-1診斷早期異位妊娠臨床診斷閾值。

1. 4 統計學方法 采用SPSS17.0統計學軟件對研究數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗;計數資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗;Netrin-1臨床診斷閾值采用ROC曲線下面積性分析。P<0.05表示差異具有統計學意義。使用Graphpad Prism 5.0進行作圖分析。

2 結果

2. 1 兩組患者Netrin-1表達水平比較 實驗組患者Netrin-1表達水平為（80.84±8.66）pg/ml ， 顯著低于對照組的（353.00±9.96）pg/ml， 差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1。

2. 2 Netrin-1診斷早期異位妊娠臨床診斷閾值? ? Netrin-1濃度診斷早期異位妊娠的ROC曲線下面積的95%可信區間為（0.911， 0.977）。據Youden's index計算Netrin-1臨床診斷閾值為226.50 pg/ml， 即Netrin-1濃度≤226.50 pg /ml考慮早期異位妊娠可能性大。

3 討論

異位妊娠是指受精卵在子宮體腔以外著床的妊娠， 是婦科常見的急腹癥， 未及時救治會影響患者預后， 嚴重地會導致孕婦死亡。隨著流行病學變化及診斷技術的提高， 目前異位妊娠發病率呈逐漸升高及年輕化趨勢[3， 4]， 如何提高早期異位妊娠診斷率， 尤其是對于需保留輸卵管的孕婦， 減少對女性身心健康損害是目前婦產科醫師必須面臨的一個重要課題。

最近研究發現， Netrin-1及其受體在脊椎動物的肺、乳腺、胰腺和血管上皮中均有表達， 參與組織器官的維持及發展;進一步研究發現， Netrin-1從屬于Netrins家族， Netrins是一種與層粘蛋白相關的蛋白家族， 在進化過程中具有高度保守性[5]。相關研究[6]表明， Netrin-1是一種分泌與軸突生長和遷移有關的蛋白質， 其在血管生成及中樞神經系統發育過程中起關鍵作用。從解剖學和細胞水平來看， 血管和神經系統的發生過程具有一定的相似性， 都是多分枝和高度復雜的網絡。在早孕期間， 胚泡植入后， 細胞滋養細胞便開始不斷增生、融合及侵襲血管， 形成絨毛， 絨毛生長的過程中伴隨著血管的新生， 新生血管發生過程與滋養細胞及內皮細胞功能密切相關， 并受到血管新生因子的調節， 其中包括了Netrins。研究證實Netrin-1與促進胎盤血管形成及胎盤著床位置有關[1， 6， 7]， 同時亦可影響胚胎的活力。研究發現[8， 9]， Netrin-1能促進人絨毛膜外滋養細胞的增殖和侵襲能力。王珺等[2]研究發現， Netrin-1低表達與胚胎停止發育有關。本研究結果中， 實驗組患者Netrin-1表達水平為（80.84±8.66）pg/ml ， 顯著低于對照組的（353.00±9.96）pg/ml， 差異有統計學意義（P<0.05）。與文獻報道一致。Netrin-1濃度在診斷異位妊娠及宮內早孕的ROC曲線下面積95%可信區間為（0.911， 0.977）， Netrin-1臨床診斷閾值為226.50 pg/ml， 與臨床診斷相符合， 但因為該研究中樣本量為200例， 樣本量較小， 此外， 有部分宮內早孕及早期異位妊娠停經時間短， 部分宮內早孕超聲下未見卵黃囊及部分早期異位妊娠還沒有超聲異位妊娠部位的改變， 因此， 利用Netrin-1濃度來進行早期異位妊娠的臨床診斷可能會有一定誤差及偏倚， 在提高診斷閾值方面尚需大樣本研究來提高早期異位妊娠診斷率。

綜上所述， 胚泡著床及妊娠的維持受到了Netrin-1的調節， 當Netrin-1水平降低， 滋養細胞功能受損， 絨毛血管發生障礙， 異位妊娠發生可能性加大。

參考文獻

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[7] 楊昀， 鄒麗， 徐可樹. 軸突導向因子netrin-1在子痛前期患者胎盤組織中的表達及其與胎盤新生血管形成的關系. 中華婦產科雜志， 2006， 41（9）：597-600.

[8] 楊昀， 王勇， 杜燕， 等. 軸突導向因子netrin-1在滋養層細胞侵襲中的作用. 中華婦產科雜志， 2009， 44（2）：131-134.

[9] 鐘少平， 沈華祥， 劉霞， 等. 可溶性Netrin-1受體對人滋養細胞株TEV-1增殖凋亡的影響. 浙江醫學， 2013， 35（3）：159-162.

[收稿日期：2020-01-02]