菜地土壤中纖維素降解菌的篩選及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化

宋旭來 耿慧 王蘭萍

摘要? ? 利用傳統(tǒng)的微生物學(xué)方法，從菜地土壤中篩選出高產(chǎn)纖維素酶的菌株，并對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，從4種菜地土壤中共分離獲得16株纖維素降解菌，其中生菜地土壤中獲得的菌株最多，白菜地土壤中獲得的菌株最少;在16個(gè)菌株中，從油菜地中分離純化的1個(gè)菌株具有最強(qiáng)的纖維素降解能力;對(duì)該菌株的產(chǎn)酶條件優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，以麩皮作為唯一碳源、培養(yǎng)溫度35 ℃、培養(yǎng)時(shí)間96 h時(shí)酶活力最高。

關(guān)鍵詞? ? 菜地土壤;纖維素降解菌;篩選;產(chǎn)酶條件

中圖分類號(hào)? ? X703? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? ? A

纖維素酶是一種能夠在分解纖維素時(shí)起生物催化作用的酶，可以將纖維素分解成寡糖或單糖。纖維素酶廣泛存在于自然界中的細(xì)菌、真菌和一些動(dòng)物的體內(nèi)[1-3]。通常使用的纖維素酶主要來自于真菌，比較典型的有木霉屬、曲霉屬和青霉屬。纖維素酶在農(nóng)作物秸稈降解過程中起著至關(guān)重要的作用，是秸稈高效利用的關(guān)鍵因素[4-7]。經(jīng)纖維素酶處理后的農(nóng)作物秸稈可用于肥料、飼料、生活燃料以及食用菌培養(yǎng)基質(zhì)等方面，能夠?yàn)槟茉础⑹称贰⒒ぁ⒓徔棥⑨t(yī)療等領(lǐng)域提供基礎(chǔ)原料，其產(chǎn)生的纖維素被認(rèn)為是地球上分布最廣、數(shù)量最多的可再生有機(jī)資源。

本研究通過從菜地土壤中篩選纖維素降解菌株，優(yōu)化菌株的產(chǎn)酶條件，以期為農(nóng)作物秸稈高效生產(chǎn)纖維素提供基礎(chǔ)材料。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 土壤樣品采集

試驗(yàn)從江蘇省鹽城市市郊菜地（青菜地、油菜地、白菜地、生菜地）中，距表層土壤5 cm處挖取土壤約50 g，用無菌袋密封采集的樣品，編號(hào)后置于冰盒中，實(shí)驗(yàn)室4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2? ? 培養(yǎng)基制備

菌種富集培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，水1 000 mL。

選擇性培養(yǎng)基（羥甲基纖維素鈉CMC-Na培養(yǎng)基）：CMC-Na 10 g，（NH4）2SO4 4 g，KH2PO4 4 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蛋白胨1 g，瓊脂16 g，水1 000 mL。

纖維素剛果紅鑒別培養(yǎng)基：（NH4）2SO4 2 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO4 1 g，NaCl 0.5 g，微晶纖維素2 g，剛果紅0.4 g，瓊脂20 g，水1 000 mL。

種子培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值為7.0～7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基：NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母粉5 g，CMC-Na 10 g，水1 000 mL。

碳源發(fā)酵培養(yǎng)基：NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母粉5 g，葡萄糖或淀粉或秸稈粉各10 g，水1 000 mL。

上述各種培養(yǎng)基均置于121 ℃滅菌20 min，配制固體培養(yǎng)基時(shí)需要按照比例添加瓊脂粉。

1.3? ? 菌株分離與純化

采集的土壤樣品作預(yù)處理，具體方法參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。每個(gè)樣品稱取2份，每份1 g。一份樣品作風(fēng)干處理（平攤于白紙上，放置于室內(nèi)自然風(fēng)干20 d），用于分離放線菌;將風(fēng)干的土樣放入75%乙醇消毒過的玻璃研缽中，加入10 mL無菌水，在超凈工作臺(tái)中研磨10 min，靜止5 min后取上清液備用。另一份樣品不風(fēng)干，其余的步驟與風(fēng)干樣品的處理相同。

采用PDA平板培養(yǎng)基梯度稀釋法分離菌種[9]。在超凈工作臺(tái)中，移液器移取上述預(yù)處理的土壤樣品上清液1 mL作為原液，加入裝有9 mL無菌蒸餾水的試管中，作為10-1濃度梯度的樣品液。重復(fù)同樣的操作，則依次得到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6濃度的樣品溶液。稀釋均勻后，用無菌定量吸管移取各濃度的樣品溶液0.3 mL，移入分離培養(yǎng)基平板上，用滅菌涂布器將樣品溶液均勻涂布至整個(gè)平板，在培養(yǎng)皿上作相應(yīng)標(biāo)記。涂布完成后，將平板倒置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)菌的培養(yǎng)時(shí)間一般為3～6 d，真菌的培養(yǎng)時(shí)間為4～14 d，放線菌的培養(yǎng)時(shí)間為7～17 d。

采用平板劃線法純化菌株。在上述培養(yǎng)基上選取長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株，用滅菌接菌環(huán)挑取菌落的孢子或菌絲，接種于無菌純化培養(yǎng)基平板，連續(xù)劃線后倒置于30 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)時(shí)間為3～7 d，定期觀察各平板上的菌落顏色和形態(tài)的一致性。如果僅通過一次劃線法不能將菌株純化，需要多次劃線純化，直到整個(gè)培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)一致，表明單菌株純化成功。

1.4? ? 纖維素降解菌株的鑒定

將分離純化得到的菌株接種于CMC-Na選擇性培養(yǎng)基平板上，在28 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)48 h，每個(gè)菌株設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

參照文獻(xiàn)[10]中提供的方法，將獲得的菌株轉(zhuǎn)接到纖維素剛果紅鑒別培養(yǎng)基平板上，每個(gè)菌株設(shè)置3個(gè)重復(fù)，28 ℃、160 r/min培養(yǎng)48 h。根據(jù)纖維素剛果紅培養(yǎng)基平板上的透明圈直徑（D）和菌落直徑（d）大小，初步判斷菌株降解纖維素能力。選取Hc值（Hc=D/d，即透明圈直徑與菌落直徑的比值）較大、生長(zhǎng)快速的菌落劃線分離純化后保存[11-12]。

纖維素酶高產(chǎn)菌株的篩選：將產(chǎn)透明圈大且生長(zhǎng)快速的菌株接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃、160 r/min培養(yǎng);每隔24 h取樣1次，3 000 r/min 離心10 min，收集上清液測(cè)定酶活力。參考文獻(xiàn)[13]中的方法測(cè)定酶活力。

1.5? ? 纖維素降解菌株產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響：取1 mL菌株培養(yǎng)液接種于10 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別在20、25、30、35、40、45、50 ℃培養(yǎng)3 d，測(cè)定其羧甲基纖維素酶活力。

碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響：分別在不同的碳源培養(yǎng)基（葡萄糖、蔗糖、淀粉、麩皮、秸稈）中接種1 mL菌株培養(yǎng)液，培養(yǎng)3 d，測(cè)定其羧甲基纖維素酶活力。

培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響：取1 mL菌株培養(yǎng)液接種于10 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)24、48、72、96、120、144、168 h，測(cè)定其羧甲基纖維素酶活力。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 菜地土壤中纖維素降解菌株的分離純化結(jié)果

經(jīng)過一系列連續(xù)分離純化培養(yǎng)，依據(jù)剛果紅染色后能夠產(chǎn)生透明水解圈的標(biāo)準(zhǔn)，分別從青菜地、油菜地、白菜地、生菜地土壤中初步篩選獲得4株（QC-1、QC-2、QC-3、QC-4）、4株（YC-1、YC-2、YC-3、YC-4）、2株（BC-1、BC-2）和6株（SC-1、SC-2、SC-3、SC-4、SC-5、SC-6）纖維素降解菌株（圖1）。

從羧甲基纖維素酶活力復(fù)篩結(jié)果可以看出，在所有測(cè)定的16個(gè)菌株中，YC-3的Hc值最大（表1），初步判斷其降解纖維素能力最強(qiáng)。經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)后，菌株YC-3產(chǎn)生的羧甲基纖維素酶活力為4.47 U/mL，高于其他菌株的酶活力值，表明最佳纖維素降解菌株是YC-3。因此，根據(jù)透明圈與菌落直徑的比值以及菌株的酶活力值大小可以看出，油菜地中分離純化的菌株YC-3的降解能力最強(qiáng)，確定將對(duì)其產(chǎn)酶條件作進(jìn)一步分析。

2.2? ? 菌株的產(chǎn)酶條件優(yōu)化結(jié)果

菌株產(chǎn)酶活力大小與培養(yǎng)溫度的關(guān)系如圖2所示，菌株酶活性隨著培養(yǎng)溫度的增加而逐漸增強(qiáng)，在最適培養(yǎng)溫度35 ℃時(shí)達(dá)到最大酶活力值，之后隨著溫度的升高呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

菌株產(chǎn)酶活力大小與培養(yǎng)基碳源的關(guān)系如圖3所示，以麩皮作為培養(yǎng)基唯一碳源時(shí)的菌株產(chǎn)酶活力較高，以葡萄糖、蔗糖、淀粉、秸稈作為培養(yǎng)基唯一碳源時(shí)的菌株產(chǎn)酶活力則依次降低。

菌株產(chǎn)酶活力大小與培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系如圖4所示，在整個(gè)培養(yǎng)過程中，菌株的產(chǎn)酶活性整體出現(xiàn)先增后減的變化趨勢(shì)，菌株的最佳產(chǎn)酶時(shí)間為培養(yǎng)96 h。

3? ? 結(jié)論與討論

人們從土壤和動(dòng)物消化道中篩選出許多種纖維素降解菌用于生產(chǎn)纖維素酶。這些篩選得到的纖維素降解菌能夠?qū)⒗w維素降解為纖維素二糖或葡萄糖等小分子有機(jī)物，以實(shí)現(xiàn)農(nóng)作物秸稈的資源化利用目標(biāo)。運(yùn)用傳統(tǒng)的微生物學(xué)方法，已經(jīng)從植物根際土壤、濕地土壤、熱泉土壤、酸性土壤等中篩選得到產(chǎn)酶能力較強(qiáng)的纖維素降解菌株，主要涉及枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱類芽孢桿菌、木霉、青霉、棘孢曲霉、尖孢鐮刀霉、黑曲霉和米曲霉等[14-20]。從這些不同類型土壤中分離純化獲得的菌株經(jīng)鑒定屬于細(xì)菌、真菌和放線菌，主要以細(xì)菌和真菌為主。

本研究采用富集培養(yǎng)法和剛果紅纖維素培養(yǎng)基法，從菜地土壤中共分離獲得16株纖維素降解菌，其中生菜地土壤中獲得的菌株最多，白菜地土壤中獲得的菌株最少。運(yùn)用酶活力測(cè)定法進(jìn)一步篩選，從16個(gè)菌株中篩選出1株具有最高酶活力的纖維素降解菌，系從油菜地中分離純化獲得。進(jìn)一步對(duì)該菌株發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化研究表明，在添加麩皮作為培養(yǎng)基碳源、最適培養(yǎng)溫度35 ℃時(shí)達(dá)到最大酶活力值，最佳產(chǎn)酶時(shí)間為培養(yǎng)96 h。然而，對(duì)纖維素酶活力影響較大的因素是碳源的種類和性質(zhì)，導(dǎo)致菌株對(duì)各種碳源物質(zhì)具有特定的代謝偏好性。本研究中，雖然麩皮和葡萄糖作為唯一碳源時(shí)的產(chǎn)酶活力都相對(duì)較高，但從經(jīng)濟(jì)效益的角度考慮，麩皮是優(yōu)先選擇的碳源。優(yōu)先選擇麩皮的原因在于麩皮是一種來源廣泛的農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物，價(jià)格低廉，利用其作為菌株的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，更能夠有效地降低生產(chǎn)纖維素酶的經(jīng)濟(jì)成本。

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