海南西海岸紅樹林伴生植物內生放線菌多樣性及其延緩衰老活性初篩

李蜜 易湘茜 楊彩妮 龐曉婷 姜舒 高程海

摘 要：為尋找新型抗衰老藥物，該文以海南西海岸紅樹林伴生植物為研究對象，采用9種不同培養基從7種伴生植物21份樣品中分離純化放線菌，通過PCR擴增，16S rRNA基因序列分析已純化放線菌的多樣性，利用秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans） 模型篩選菌株來進行延緩衰老活性研究。結果表明：（1）從7種伴生植物21份樣品中共分離到26株海洋放線菌，隸屬于9科15屬，分別為擬諾卡菌屬、短狀桿菌屬、短小桿菌屬、Demequina、戈登氏菌屬、類諾卡氏菌屬、Lysinimicrobium、細桿菌屬、假諾卡氏菌屬、微球菌屬、原小單孢菌屬、擬無枝酸菌屬、Yimella、北里孢菌屬和鏈霉菌屬，其中鏈霉菌屬為優勢菌屬。（2）經秀麗隱桿線蟲模型篩選，發現有2株海洋放線菌的發酵粗提物具有延緩秀麗隱桿線蟲衰老的作用。綜上結果說明海南西海岸紅樹林伴生植物中含有豐富多樣的藥用放線菌資源，為海洋放線菌抗衰老研究奠定了基礎。

關鍵詞：伴生植物，物種多樣性，內生放線菌，抗衰老活性

Abstract：In order to search for new anti-aging drugs，actinobacteria were isolated from seven associated mangrove plants and nine different isolation media. The strain diversities were analyzed by using PCR amplification and comparison of 16S rRNA gene sequences. The anti-aging activities of the actinobacteria were analyzed by using Caenorhabditis elegans screening models. The results were as follows：（1） A total of 26 marine actinobacteria were isolated from 21 samples of seven associated mangrove plants，belonging to nine families and fifteen genera consist of Nocardiopsis，Brachybacterium，Curtobacterium，Demequina，Gordonia，Nocardioides，Lysinimicrobium，Microbacterium，Pseudonocardia，Micrococcus，Promicromonospora，Amycolatopsis，Yimella，Kitasatospora and Streptomyces，and the dominant genus was Streptomyces. （2） Two kinds of actinobacteria were found to have anti-aging effect by Caenorhabditis elegans screening models. All the above results indicate that there are abundant medical actinobacteria resources in the west coast of Hainan，and the study provides research fundamental data for anti-aging research of marine actinobacteria.

Key words：associated mangrove plants，species diversity，endophytic actinobacteria，anti-aging activity

紅樹林是熱帶亞熱帶海岸潮間帶的木本植物群落，其伴生植物指偶爾出現于紅樹林最內緣或邊緣地帶的海岸、海濱、鹽生或陸生植物，被認為是紅樹林的邊緣物種（陶曙紅等，2016）。近年來，隨著陸地生物資源的廣泛研究和日漸枯竭，海洋微生物資源備受科學家們的關注。許多海洋微生物與海洋動植物共生，以獲得生存必需的營養（李艷華和張利平，2003）。海南西海岸分布著豐富多樣的紅樹林植物，為保護國家資源建立了多個紅樹林自然保護區，包括儋州新英灣紅樹林市級自然保護區、臨高文瀾江縣級自然保護區和臨高彩橋紅樹林縣級自然保護區等，為科學研究提供豐富的研究材料。與其他近海環境相比，紅樹林是分離放線菌的理想環境（洪葵，2013）。目前已發現22 000多個微生物活性產物，其中約70%由海洋放線菌產生，具有多種生理活性，包括抗菌、抗腫瘤、抗病毒、增強免疫等（Manivasagana et al.，2014）。李飛娜等（2017）從澳門紅樹林植物中分離到192株內生放線菌，其中獲得2株放線菌新種，6株潛在放線菌新種中5株具有抗菌活性。有研究報道，海洋放線菌ACMA006的發酵產物具有很強的抗腫瘤活性和較好的抑菌活性（袁獻溫和楊瑞麗，2009）。有關微生物次級代謝產物的藥理活性報道很多（李菲等，2017;袁獻溫和楊瑞麗，2009），但對于微生物抗衰老方面的研究則相對較少。線蟲是經典模式生物，具有生命周期短、易培養、易觀察、基因組容量小且圖譜清晰等優勢（呂婷，2014），目前已廣泛應用到抗衰老藥物的篩選和研究過程中（呂婷，2014;王艷菊等，2014）。隨著社會的發展和人們生活水平的不斷提高，人口老齡化已成為當前不可阻擋的趨勢（薛曉利等，2017）。2010年全國60歲以上的老年人口占人口總數的13.26%，預計到21世紀中葉，將達到4.5億，約占總人口的1/3（曾爾亢等，2012）。由此可見，抗衰老藥物的研究是當前重要而緊迫的任務（呂婷，2014）。

目前，國內外關于線蟲延緩衰老模型的研究主要集中于中藥提取物和保健產品的延緩衰老研究（黃正杰等，2013），而關于利用海洋微生物發酵產物對線蟲衰老模型的研究報道較少。海洋微生物擁有獨特的活性次級代謝產物，其代謝產物的抗衰老研究值得深入探討。到目前為止，未見有關于紅樹林伴生植物共生微生物多樣性的研究報道。本研究采用秀麗隱桿線蟲作為延緩衰老研究的模式生物，以特殊生境的海洋伴生植物為研究對象，采用純培養技術開展其內生放線菌多樣性及其發酵產物對線蟲衰老活性的研究，為研究紅樹林放線菌群落組成提供參考，以及期望獲得強活性菌株，為開發新型抗衰老藥物提供強活性菌源。

1 材料與方法

1.1 材料

所用材料為7種伴生植物樣品：海馬齒（Sesuvium portulacastrum）、厚藤（Ipomoea pes-caprae）、魚藤（Derris trifoliata）、曼陀羅（Datura stramonium）、苦郎樹（Clerodendrum inerme）、猩猩草（Euphorbia cyathophora）、彎枝黃檀（Dalbergia candenatensis）。材料由廣西中醫藥大學高程海研究員鑒定。樣品于2017年7月采集于海南西海岸的紅樹林，經緯度、物種編號、植物種類及組織等信息見表1所示。分別采取花、莖、葉和胚軸，先用無菌水沖洗樣品表面3遍，立即裝入密封采樣袋，置于采樣冰盒中24 h內送回實驗室;然后進行研磨、稀釋涂布、培養。野生秀麗線蟲用于本研究抗衰老活性的初步篩選，由廣西科學院汪斌博士惠贈。

1.2 方法

1.2.1 伴生植物樣品的處理 去除伴生植物表面的雜質，分別選取完整無病蟲害的花、莖、葉、胚軸進行表面消毒，先用5%的次氯酸鈉溶液浸泡8 min，無菌水沖洗3次;再用75%的酒精溶液浸泡5 min，無菌水沖洗3次。分離培養基參考李飛娜等（2017）。分別取少量表面消毒后的植物材料約2 g于研缽中充分研磨，吸取2 mL無菌水與研磨后的漿液混勻，此濃度液作為樣品原液，再依次稀釋到104組織懸液。分別取100 μL 104組織懸液涂布在9種分離培養基（AGG、M4、M5、M7、M9、M10、ISP7、ISP3和M11）上，樣品原液置于4 ℃冰箱暫存。

1.2.2 菌株的分離純化及保藏 參考吳家法等（2017）的方法，分離平板置于28 ℃恒溫培養箱培養2～8周通過形態觀察，挑選質地致密程度較高，邊緣內陷明顯的放線菌菌落在ISP2培養基上進行三區劃線純化，如有雜菌則進行二次純化或多次純化，直至得到單一純凈的菌落，并記錄菌落數及菌落的形態特征。獲得純菌株采用Chelex-100法（周雙清等，2010）提取基因組DNA;參照Walsh et al.（1991）的方法進行PCR梯度擴增，擴增引物為通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。

PCR反應條件：94 ℃預變性5 min，后進行30 個循環（94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s），循環結束后，72 ℃延伸10 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用Bio-RAD凝膠成像儀觀察電泳結果。Gel Logic 2200 Pro凝膠成像儀檢驗條帶合格后委托上海美吉生物醫藥技術有限公司廣州分公司進行測序。測序結果經DNA Star軟件整理，利用數據庫EzBioCloud（http：//www.eztaxon.org/）（Kim et al.，2009）及Blast網站進行在線比對;對16S rRNA基因序列進行相似性比對搜索。將純化好的菌株制成20%（V/V）甘油管保存于-80 ℃超低溫冰箱中。

1.2.3 放線菌粗提物的制備 參考覃媚等（2016）的方法，從ISP2 固體培養基上挑取26株對數生長期的菌絲接種到200 mL ISP2液體培養基中，在恒溫振蕩培養箱中28 ℃、180 r·min1發酵7 d;離心收集發酵液，發酵液用乙酸乙酯萃取（用符號E表示），取上層乙酸乙酯層濃縮備用;菌體（用符號T表示）用丙酮破壁后甲醇萃取濃縮干燥，收集粗提物，用于線蟲抗衰老活性的初步篩選。

1.2.4 線蟲的壽命實驗 參考Lakowski & Hekimi （1998）的方法，檢測26株放線菌發酵粗提物是否具有延緩線蟲衰老的作用。將線蟲涂布于含有OP50的NGM（nematode growth media）固體培養基上，置于20 ℃恒溫培養箱培養約48 h后可見L4期成熟線蟲，此時線蟲可用于實驗（Brenner，1974）。NGM固體培養基（黃正杰等，2013）：Nacl 3 g，蛋白胨 2.5 g，Agar 17 g，去離子水975 mL。121 ℃，20 min，滅菌后，待培養基溫度降至55 ℃，依次加入CaCl2 1 mL，MgSO4 1 mL，K3PO4 25 mL，5 mg·mL1膽固醇1 mL，混勻后，倒入一次性平板，平板至少放置1 d后可用或置于4 ℃下一個月內使用完畢。

線蟲的同期化：取傳代后線蟲用約10 mL的M9緩沖液（Na2HPO4 6 g，KH2PO4 3 g，NaCl 5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，去離子水1 L）重復清洗到15 mL離心管中，用微孔濾膜過濾，取下層液體備用。100 mL大腸桿菌發酵液離心，去掉上清液，備用。取含有大量蟲卵的液體滴加于涂布有OP50的NGM平板中心，平板中還需加入一定量的FDU抑制線蟲后代的產生。

壽命實驗：將菌體粗提物樣品浸膏溶解于2% DMSO 中，終濃度為100 mg·L1（實驗組），阿維菌素100 mg·L1（陽性對照），DMSO 0 mg·L1（空白對照）涂布于含有OP50的NGM平板上，每塊平板挑去20條處于L4期的線蟲，每組取5個平板，置于20 ℃下恒溫箱培養，此時記為壽命實驗第0天。每天觀察并記錄線蟲存活的數量。DMSO在線蟲壽命實驗中的安全劑量為2%，本研究未超過安全使用劑量，不會影響實驗結果。

活性菌株粗提物液質譜圖：取具有延緩線蟲衰老活性的菌株粗提物5 mg，配制成一定濃度的溶液來進行液質聯用（HPLC-MS）譜圖掃描，液相色譜柱為 Luna 5u C18（2） 100A 150 mm × 4.60 mm 5 micron，流動相為甲醇-水（含0.1%甲酸），流速為1 mL·min1，分析時間為 50 min，梯度洗脫。質譜采用電噴霧離子源（ESI 源），源噴射電壓（IS）為4 500 V，霧化溫度為180 ℃。根據質譜圖信息分子離子峰，通過查閱SciFinder來初步推斷代謝產物類型。

1.3 統計分析

所有數據采用SPSS Statistics 17.0進行統計分析，圖表采用Excel 2013和Graphpad prim 5繪制，通過DNA Star軟件進行序列整理和MEGA5.0軟件構建系統發育樹及聚類分析，DataAnalysis進行液質聯用分析。

2 結果與分析

2.1 紅樹林伴生植物內生放線菌多樣性分析

根據菌落形態特征進行初步排重后，選擇62株菌進行16S rRNA基因擴增和序列比對分析，結果表明62株細菌中26株為放線菌，分布于6個目9個科15個屬。26株內生放線菌在15個屬的多樣性分布如圖1所示，鏈霉菌屬（Streptomyces）分離出5株菌，占所分離放線菌株總數的19.23%。此次研究分離到的稀有放線菌包括擬諾卡菌屬（Nocardiopsis）、短狀桿菌屬（Brachybacterium）、短小桿菌屬（Curtobacterium）、Demequina、戈登氏菌屬（Gordonia）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）、Lysinimicrobium、細桿菌屬（Microbacterium）、假諾卡氏菌屬（Pseudonocardia）、微球菌屬（Micrococcus）、原小單孢菌屬（Promicromonospora）、擬無枝酸菌屬（Amycolatopsis）、Yimella、北里孢菌屬（Kitasatospora），占分離放線菌總數的80.76%。

26株可培養內生放線菌的物種組成見表2。

根據放線菌菌株與典型菌株比對，16S rRNA基因序列相似性小于98.5%的菌株是新種的可能性為80%（徐麗華等，2007）。16S rRNA基因序列相似性比對分析結果顯示菌株IMDGX 6028、IMDGX 6049、IMDGX 6137、IMDGX 6173、IMDGX 6270、IMDGX 6239和IMDGX 6469-1與有效發表菌株Amycolatopsis niigatensis、Brachybacterium sacelli、Microbacterium saccharophilum、Lysinimicrobium pelophilum、Brevibacterium permense、Nocardiopsis prasina和Yimella lutea的最高相似度分別為97.76%、97.23%、98.15%、98.32%、97.75%、98.44%和98.39%，即這7株菌株有可能為潛在的放線菌新物種。

2.2 26株內生放線菌在植物組織、植物種類及培養基中的分布

由圖2可知，M7培養基分離得到的菌株數量和多樣性最多，分別為12株放線菌，隸屬于9個屬;其次是P3培養基，分離得到11株放線菌，隸屬于8個屬;第三是M4培養基，分離得到9株放線菌，隸屬于7個屬。其中，M7和M4兩種培養基均含有L-天冬酰胺作為氨基酸來滿足放線菌的營養需求。這三種不同的培養基分離得到的菌株數量和多樣性均較多，可作為今后培養放線菌的首選培養基。M11培養基（棉子糖-組氨酸培養基）分離得到菌株數量和多樣性均最少，為4株放線菌，隸屬于4個屬。

從不同植物組織分離得到的放線菌菌株數量和多樣性結果見圖3。從莖中分離得到的放線菌菌株數量和多樣性最多，為18株放線菌，隸屬于12個屬;其次是葉子分離得到16株放線菌，隸屬于10個屬;胚軸中分離得到的菌株數量和多樣性較少。

從圖4可見，H5苦郎樹植物分離得到13株放線菌，隸屬于8個屬;H3魚藤分離得到10株放線菌，隸屬于5個屬;H7彎枝黃檀分離得到8株放線菌，隸屬于8個屬。

根據液質聯用譜圖信息可知，IMDGX 6193T的代謝產物在3.3 min存在一較明顯的峰，IMDGX 6364T在3.0 min有明顯的峰，分析兩活性菌株的高分辨質譜圖可知分子離子峰分別為MS m/z 305.2110和MS m/z 190.1078，根據SciFinder檢索初步推斷其代謝產物分別為Elsinopirin A （Frank et al.，2018）和N-Methylcalystegine B3（Naoki et al.，1997），其中Elsinopirin A的化學結構如圖5所示。

3 討論與結論

我國紅樹林主要分布于海南、廣東、廣西、福建及臺灣、香港、澳門等地。紅樹林相比陸地環境，強輻射、高鹽和低氧等特殊生境，所蘊育的放線菌類群豐富，使放線菌具有更高的拮抗性。近年來，紅樹放線菌及其次生代謝產物的研究逐漸增多（吳家法等，2017;李菲等，2017）。許敏等（2016）從廣東湛江紅樹林植物中分離得到的內生放線菌中有3株具有較強殺線蟲活性，同時22.64%菌株具有抗生素合成基因簇。為探索海南西海岸紅樹林伴生植物內生放線菌資源的特征，本研究對采集的7種伴生植物，利用9種分離培養基，對樣品各個部位的內生放線菌進行分析，共分離獲得內生放線菌26株，隸屬于6個目9個科15個屬。植物不同部位，其內生放線菌的含量有所不同，莖中分離的放線菌含量最多，葉子中次之，胚軸中最少。海南西海岸海洋生物多樣化，本研究從伴生紅樹中分離發現8株鏈霉菌外，還發現短狀桿菌屬（Brachybacterium）、短小桿菌屬（Curtobacterium）、戈登氏菌屬（Gordonia）、北里孢菌屬（Kitasatospora）等稀有放線菌，為尋找新抗生素提供豐富菌源。

以線蟲為模型測定26株內生放線菌是否具有抗衰老活性。結果顯示，2株內生放線菌Pseudonocardia carboxydivorans和Streptomyces marokkonensis具有顯著延緩線蟲衰老的活性，分別歸屬于假諾卡氏屬和鏈霉菌屬。根據液質聯用譜圖信息，可知這兩株放線菌分別含有結構類似N-Methylcalystegine B3和Elsinopirin A的化合物。據報道，Pseudonocardia carboxydivorans可從土壤和植物樣品中分離得到（Navarromartinez et al.，2017），Park et al.（2008）發現它對枯草芽孢桿菌類可產生抑制作用。Tanvir et al.（2016）通過HPLC-MS測試其主要活性次級代謝產物為酰胺類化合物。本研究通過秀麗隱桿線蟲的衰老模型表明兩者均能顯著延緩線蟲衰老，具有一定的抗衰老活性。

通常環境微生物中只有1%能夠被實驗室培養（吳家法等，2017）。本實驗通過綜合各研究團隊所用的分離培養基營養成分，用9種不同營養成分的分離培養基共得到分布于9個科15個屬的26株放線菌，所獲稀有放線菌數量和種類相對較高，說明海南西海岸紅樹林伴生植物具有豐富的多樣性，為后期放線菌分離方法研究提供可靠依據，為進一步解決人類疾病的實際問題，尋找具有延緩衰老藥物提供活性菌株。目前，人類對海洋內生放線菌的了解很有限，摸索適合紅樹內生菌研究的方法，盡可能多地分離純化難培養或未培養的微生物仍是當前微生物研究的重要內容。

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