海南西海岸真紅樹內生細菌多樣性及其延緩衰老活性研究

李蜜 高程海 姜舒 韋娟 劉思萍 戴恩枝 易湘茜

摘 要：該文設計9種分離培養基，采用稀釋涂布法從14份真紅樹植物的46份組織樣品中分離純化內生細菌。并基于菌株形態學特征和16S rRNA基因序列確定分離菌株的種屬及分析其物種多樣性，采用秀麗隱桿線蟲模型篩選菌株延緩衰老活性。結果表明：（1）通過基因序列去重復后從46份真紅樹植物組織樣品中獲得32株海洋細菌，基于菌株16S rRNA基因序列信息分析，覆蓋12科17屬，其中芽孢桿菌屬（Bacillus）為優勢菌屬，并獲得1株疑似橙單胞菌屬（Aurantimonas）新種，16S rRNA基因序列相似性低于97%;（2）經過秀麗隱桿線蟲粗篩發現3株海洋細菌具有顯著延緩線蟲衰老的活性（P<0.05）。以上結果表明海南西海岸真紅樹內生細菌具有物種多樣性，部分菌株具有延緩線蟲衰老活性。

關鍵詞：真紅樹植物，內生細菌，物種多樣性，延緩衰老活性

Abstract：The bacteria were isolated and purified from 46 tissues of 14 true mangrove plants used nine kinds of isolation media by dilution coating method. The bacteria were isolated from strains，and the species and genus diversities were analyzed by bacteria morphological characteristics and 16S rRNA gene sequences. The anti-aging activities of the bacteria were tested by Caenorhabditis elegans screening models. The results were as follows：（1） The 32 marine bacteria were obtained from 46 tissues of true mangrove plants without repeatitions. The 32 bacteria to comparison of 16S rRNA gene sequences which could be classified into 12 families and 17 genera. The dominant genus were Bacillus. It was discovered that a novel strain of suspected genus Aurantimonas，which 16S rRNA gene sequence similarities were less than 97%; （2） The three cultured marine bacteria could significantly delay Caenorhabditis elegans developing and had dominant anti-aging activities（P<0.05）. All the above results indicate that the true mangrove plants collected from the west coast of Hainan have high species diversity and part strains are rich in anti-aging activity.

Key words：true mangrove plants，endophytic actinobacteria，species diversity，anti-aging activity

全世界紅樹植物共有24科30屬83種，主要分布在美洲、非洲和東南亞的熱帶和亞熱帶經濟不發達地區（Holguin et al.，2001）。中國紅樹林主要分布于福建、海南、廣東和廣西等省（區）的沿海地區，其中真紅樹植物有11科24種（廖寶文等，2014）。林鵬等（1997）認為真紅樹植物是指專一地生長于潮間帶的木本植物。紅樹林生長于缺氧、高養分和高鹽等特殊環境，可產生大量結構豐富和活性顯著的次級代謝產物（袁獻溫等，2009;沈明曦等，2011）。而生活在其組織內部的微生物，受特殊環境的影響易產生遺傳變異從而使物種多樣性豐富，代謝產物藥理活性獨特。近年來，從紅樹林植物中發現大量儲藏在植物內部的微生物，主要活性有抗菌（李家怡等，2017）、抗病毒和細胞毒（李菲等，2016）等。李家怡等（2017）從廣西山口紅樹林自然保護區采集的紅海欖中分離得到17株內生細菌，其中3株對副溶血弧菌具有較強的抑菌活性。劉月廉等（2010）從秋茄、白骨壤、無瓣海桑三種真紅樹植物的540 塊組織中分離到內生細菌90株，其中菌株AC2對致皮膚病真菌具有較強的拮抗性。李菲等（2016）采用稀釋涂布法，從無瓣海桑中分離得到38株內生細菌，其中5株具有較強的細胞毒活性。李菲等（2017）從廣西北海金海灣紅樹植物秋茄中得到50株內生細菌，并篩選出37株細菌對甘蔗黑穗霉菌有抑制作用。由此可見，真紅樹細菌資源豐富，且藥理活性獨特，其多樣性值得我們深入研究。

當代社會，人類生活水平與上個世紀相比較顯著提高，但人口老齡化趨勢日趨顯著（曾爾亢等，2012）。人口老齡化的加劇使得抗衰老不容忽視，同時也是急需解決的問題。紅樹林生態資源豐富，其中滋養著多樣性豐富的微生物，從紅樹林微生物中發現延緩衰老藥物是我們研究的關鍵問題。紅樹林位于海陸交界處，兼具有海洋和陸地的特征又存在區別。據資料顯示，真紅樹內生微生物次級代謝產物的化學和藥理活性研究報道很多，但關于微生物代謝產物粗提物延緩衰老的藥理研究相對偏少。國內外利用秀麗隱桿線蟲模型主要研究中藥提取物和保健產品的抗衰老，海洋微生物發酵產物對線蟲延緩衰老的研究鮮有報道。陳亮穩等（2013）發現蜜環菌菌索多糖能顯著延長秀麗隱桿線蟲的生存期，并對其生殖力無損害。Petrascheck et al.（2007）利用秀麗隱桿線蟲篩選抗衰老藥物，共篩選了8.8萬個化合物，發現115個化合物能延長線蟲的壽命。本課題組（李蜜等，2018）利用秀麗隱桿線蟲模型發現2株具有延緩衰老的海洋放線菌，能有效延遲線蟲的死亡時間。

海南西海岸位于北部灣灣區，其紅樹林物種多樣性豐富，并且滋生豐富的微生物資源。因此發掘其中真紅樹內生細菌多樣性差異對海洋細菌資源的開發利用具有重要意義。本實驗以海洋真紅樹植物為研究對象，采用稀釋涂布法對其展開內生細菌多樣性研究;利用秀麗隱桿線蟲衰老模型對其代謝產物粗提物進行延緩衰老活性篩選。為挖掘更多潛在新物種以及真紅樹細菌潛在的藥理活性、為研究新型抗衰老藥物提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

真紅樹植物樣品：14份真紅樹植物樣品于2017年7月采集于海南西海岸區域，具體樣品信息如表1，根部位5份樣品，莖14份，葉13份，花2份和胚軸12份，共46份真紅樹植物組織。其中，H1-H7真紅樹植物地理位置為109°59′37″ E、19°55′07″ N，H8-H14地理位置為109°31′50″ E、19°51′26″ N。樣品用無菌水沖洗其表面以去除表面雜質，立即裝入自封采樣袋，置于采樣冰盒中24 h內送回實驗室，置-20 ℃冰箱保存備用。野生型秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）、OP50尿嘧啶缺陷型大腸桿菌（Escherichia coli）均由廣西科學院汪斌博士提供。

1.2 方法

1.2.1 分離培養基 分離培養基參考李飛娜等（2017）設計如下9種，AGG：改良的高氏培養基;M4：海藻糖-天冬酰胺培養基;M5：海藻糖-脯氨酸培養基;M7：改良ISP5培養基;M9：精氨酸-天冬酰胺培養基;M10：改良淀粉-水解酪素培養基;P7：酪氨酸-天冬酰胺培養基;P3：燕麥培養基;M11：棉籽糖-組氨酸培養基。詳細配方信息如表2所示，每種培養基加入1 L海水、10 mL的復合鹽溶液和20 g的瓊脂，調節pH7.2，均于121 ℃下滅菌20 min（復合鹽溶液：KNO3 1.0 g，NaCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO4 0.5 g，NH4NO3? 0.1 g，FeSO4 0.01 g，MnCl2·H2O 0.001 g，ZnSO4·7H2O 0.001 g和去離子水10 mL）。待培養基溫度降至50 ℃時加入抑制劑重鉻酸鉀使其終濃度為25 mg·L1，混勻。

純化及保藏培養基：改良ISP2固體培養基，酵母提取物2.0 g，麥芽提取物2.0 g，葡萄糖2.0 g，瓊脂20.0 g和海水1 000 mL。

發酵培養基：ISP2液體培養基。

1.2.2 紅樹植物樣品的處理 參考李家怡等（2017）方法，對紅樹植物樣品進行表面除雜和消毒，5%次氯酸鈉溶液浸泡8 min，無菌水沖洗至沒有殘留;75%的酒精溶液浸泡5 min，無菌水沖洗至無酒精。取大約2 g的新鮮樣品進行研磨，吸取2 mL無菌水與樣品混勻，該濃度液作為樣品原液，再用無菌水依次稀釋到103和104組織懸液，置于4 ℃冰箱暫存。

1.2.3 菌株的分離純化及保藏 取103和104組織懸液0.2 mL，分別涂布于9種不同成分的分離培養基中，置于28 ℃恒溫培養箱培養14～30 d;通過形態觀察，挑選表面光滑的單菌落在ISP2培養基上進行三區劃線純化，如有雜菌則進行二次純化或多次純化，直至得到單一純凈的菌落，同時記錄菌落數及菌落的形態特征。純化好的菌株制成20%（V/V）甘油管保藏于-80 ℃。

1.2.4 PCR擴增和系統發育樹分析 采用Chelex-100 Resin法（周雙清等，2010）提取基因組DNA;并參照Walsh et al.（1991）的方法進行PCR梯度擴增。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，Bio-RAD凝膠成像儀成像觀察電泳結果。凝膠成像儀檢驗條帶合格后委托上海美吉生物醫藥技術有限公司廣州分公司進行測序。

測序結果經DNA Star軟件整理，利用數據庫EzBioCloud（https：//www.ezbiocloud.net/）（Kim et al.，2009）進行在線比對;對16S rRNA基因序列進行相似性比對搜索，從中選取相似性較高且是有效描述的典型菌株的16S rRNA基因序列作為參比對象。

1.3 延緩衰老活性實驗

1.3.1 紅樹林細菌粗提物的制備 參考覃媚等（2016）的方法：將32株對數生長期的菌株接種于200 mL液體培養基中發酵7 d，離心收集發酵液，發酵液用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯層濃縮備用;收集粗提物，置于干燥器中低溫保存。

1.3.2 NGM （nematode growth medium）培養基的配制 參考Brenner（1974）的方法：加入3 g NaCl、2.5 g蛋白胨、17 g瓊脂、1 mol·L1 K2HPO4-KH2PO4 Buffer （pH=6.0） 25 mL、975 mL蒸餾水進行滅菌。滅菌后加入抽濾除菌的5 mg·mL1膽固醇溶液1 mL、1 mol·L1 MgSO4 1 mL、1 mol·L1的 CaCl2 1 mL。

1.3.3 秀麗隱桿線蟲延緩衰老活性測試方法 真紅樹內生細菌代謝產物粗提物樣品分兩批次進行線蟲壽命實驗，第一批次總共采集得到11個樣品的壽命數據，樣品詳情如表4所示，第二批次總共采集得到8個樣品的壽命數據，具體數據如表5所示。

實驗步驟：用M9緩沖液將蟲體洗凈離心棄上清液，以1∶3的比例加入裂解液（1 mL 5 mol·L1的NaOH和0.5 mL 5%的NaClO混勻使用），震蕩離心后，分別加入20 μL大腸桿菌發酵液、30 μL線蟲pellet、150 μL M9 Buffer于96孔板的各個孔中，設置陰性對照。 置于 20 ℃ 生化培養箱中培養 48 h 后可得L4期線蟲。將培養好的L4期線蟲挑至加有藥液（藥液濃度500 μg·mL1，每次加50 μL）的NGM培養基上進行培養，每組2板，每板20條，此時培養天數記為0 d。此后，隔天對培養基的線蟲進行計數，每天觀察并記錄線蟲生存、死亡及剔除的數量，將線蟲每2 d轉移至新的培養皿，直至線蟲全部死亡。得出平均壽命和最大壽命值。

1.4 統計分析

所有數據采用軟件SPSS Statistics 17.0進行統計分析，并用軟件Excel 2013做表、繪圖，通過DNA Star軟件進行序列整理。

2 結果與分析

2.1 紅樹植物內生細菌多樣性分析

根據菌落特征進行初步排重后，選擇58株菌進行16S rRNA基因擴增和序列分析，結果表明32株為細菌，分布于4個綱10個目12個科17個屬，其物種組成多樣性分布如表3所示。32株紅樹林植物內生細菌在17個屬的多樣性分布如圖1所示，其中橙單胞菌屬（Aurantimonas）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、無色桿菌屬（Achromobacter）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）、鹽單胞菌屬（Kushneria）、Salinicola、沙雷氏菌屬（Serratia）、 根瘤菌屬（Rhizobium）、弧菌屬（Vibrio）、寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas）分別含1個種;不動桿菌屬（Acinetobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）分別含2個種;泛菌屬（Pantoea）含3個種;芽孢桿菌屬（Bacillus）為優勢菌屬含11個種占分離細菌的34.37%。從分離得到的海洋細菌中發現1株細菌的全長16S rRNA基因序列與其最近緣的典型菌株序列相似性低于97%，基于系統發育分析認為全長序列相似性低于98.65%的菌株代表潛在新屬或新種（Kim et al.，2014）。IMDGX 6574與有效發表菌株Aurantimonas coralicida DSM （14790）T的最高相似性為94.65%，為潛在的新種或新屬。

2.2 32株內生細菌在植物樣品、植物組織及培養基中的分布

32株真紅樹內生細菌在14份植物樣品、5種植物組織及9種分離培養基中的分布情況如圖2、圖3和圖4所示。其中，圖2樣品H4（1號采樣點的白骨壤）和H9（2號采樣點木果楝）分離得到的菌株數量最多，其次是樣品H2紅海欖，分離得到12株細菌。從不同組織分離得到的細菌種屬多樣性與數量結果如圖3所示，如從葉子獲得的菌株數量最多（22株），相應地其種屬多樣性也最豐富（12個屬），根中分離得到的菌株數量最少（6株），相應地其種屬多樣性也較少（3個屬）。根據9種分離培養基的分離效果可知，圖4中M7培養基（改良ISP5培養基）分離得到的菌株數量和多樣性均最多，其主要營養成分為酵母粉與L-天冬酰胺;M10培養基（改良淀粉-水解酪素培養基）分離得到菌株數量和多樣性較高;M9培養基（精氨酸-天冬酰胺培養基）分離得到菌株數量和多樣性均最少。因此，M7（改良ISP5培養基）與M10（改良淀粉-水解酪素培養基）培養基可為今后分離純化細菌工作提供培養基成分參考。

2.3 真紅樹植物內生細菌發酵產物延緩衰老活性分析

內生細菌的延緩衰老活性數據，采用 SPSS Statistics 17.0 軟件進行分析，采用方差分析進行兩兩比較。由表4第一批研究結果可知編號IMDGX 6198寡養單胞菌屬的Stenotrophomonas rhizophila與空白對照相比P<0.01，差異極顯著，并且具有統計學意義。表5所示，第二批次樣品中編號IMDGX 6121-1不動桿菌屬的Acinetobacter soli與對照組比較（P<0.01），IMDGX 6355泛菌屬的Pantoea anthophila與對照組比較（P<0.05）具有顯著差異，能顯著延長線蟲壽命。

研究結果分析顯示IMDGX 6198、IMDGX 6355和IMDGX 6121-1，3株真紅樹內生細菌能顯著延緩線蟲衰老，分別與相對應批次的空白組比較平均壽命可分別達到（19.62±1.04）、（19.63±6.72）和（22.70±0.94）d，最大壽命可達到21.68、21.37和24.57 d。據Huang et al.（2004）研究可知壽命長短是衰老過程研究中的一個主要依據，線蟲的衰老過程伴隨著生理功能的衰減。因此，研究線蟲的壽命可評價微生物代謝產物的延緩衰老活性。

3 討論與結論

隨著普通環境下篩選新化合物的幾率逐漸下降，人們開始把注意力轉向了特殊生境的微生物資源（李文均等，2003）。海南西海岸紅樹林資源豐富、生長環境獨特，同時也為其內生菌提供了特殊的生態環境。為豐富海南西海岸真紅樹內生細菌的多樣性及生物活性，本研究選擇14份真紅樹植物的46份組織樣品，利用9種不同營養成分的分離培養基分離純化其中的內生細菌，共分離培養內生細菌32株，隸屬于12科17屬，其中11株芽孢桿菌（Bacillus）（占34.37%），為優勢菌群。

可見，芽孢桿菌在真紅樹內生微生物中占統治地位，這與李菲等（2017）研究結果相同。本研究從真紅樹植物的13份葉子中分離到22株內生細菌，數量最多，其次從14份莖中分離到17株，12份胚軸樣品中得到15株，2份花中得到7株和5份根部位樣品得到6株。葉子中分離得到的細菌種類最多，其次是莖和胚軸，花與根部位最少，此研究結果與其他學者相比較存在差異（陳振明等，2006;魏玉珍等，2010;李家怡等，2017）。推測原因可能是采樣地點和季節、采集樣品的老嫩程度和采集樣品部位的數量、樣品處理方式和外部環境所致。因此，海南西海岸同一種真紅樹內生細菌的分布及其生物學特性是否具有組織特異性，還需進一步深入探索。

利用秀麗隱桿線蟲模型篩選內生細菌的延緩衰老活性。檢測結果顯示，3株真紅樹內生細菌Stenotrophomonas rhizophila、Pantoea anthophila和Acinetobacter soli皆具有顯著延緩線蟲衰老的活性，分別隸屬于寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas）、泛菌屬（Pantoea）和不動桿菌屬（Acinetobacter）。活性菌株Stenotrophomonas rhizophila曾被報道從石油污染的土壤上分離得到（Kumar et al.，2015）。Acinetobacter soli能高效降解食物中的聚山梨酸酯（Nguyen，2018），該屬細菌可分泌表面活性劑，能有效降解石油烴以降低石油烴的生物毒性（劉玉華等，2016）。由此可見，篩選到的兩株活性菌株具有開發成為藥物、保健食品及化工產品的潛力。在本次研究中，菌株Stenotrophomonas rhizophila從紅海欖根（H2）、白骨壤莖（H4）、紅樹根（H12）、木欖胚軸（H13）中均分離得到，Pantoea anthophila于木果楝葉子（H9）中分離得到，Acinetobacter soli可從木果楝莖（H9）以及瓶花木胚軸（H10）中分離得到。由此可見，同一海域不同采集地點和不同植物組織均可分離到相同的菌株。

就新穎性而言，從海南西海岸桐花樹葉子中發現1株Aurantimonas sp.的潛在新種，其與已發表的菌株Aurantimonas coralicida DSM 14790T（ATXK01000033）的16S rRNA基因序列相似性低于97.00%。因此，下一步將對潛在新菌開展多相分類鑒定及對3株具有延緩衰老活性的菌株進行發酵條件的優化，并分析其發酵代謝產物的化學組成及其抗衰老機理，以期為海洋延緩衰老藥物的開發與利用奠定基礎。

參考文獻：

BRENNER S，1974. The genetics of Ceanorhabditis elegans [J]. Genetics，77（1）：71-94.

CHEN ZM，HE JJ，HE H，et al.，2006. Isolation and screening of endophytic antifungal bactetia mangroves [J]. Microbiol Chin，33（3）：18-23. [陳振明，何進堅，何紅，等，2006. 紅樹林內生細菌的分離及拮抗菌篩選 [J]. 微生物學通報，33（3）：18-23.]

HUANG C，XIONG C，KORNFRLD K，2004. Measurements of age-related changes of physiological processes that predict lifespan of Caenorhabditis elegans [J]. Proc Natl Acad Sci USA，101（21）：8084-8089.

HOLGUIN G，VAZQUEZ P，BASHAN Y，2001. The role of sediment microorganisms in the productivity，conservation，and rehabilitation of mangrove ecosystems：An overview [J]. Biol Fert Soils，33 （4） ：265-278.

KIM KH，ROH SW，CHANG HW，et al.，2009. Nitratireductor basaltis sp. nov. isolated from black beach sand [J]. Int J Syst Evol Microbiol，59（1）：135-8.

KUMAR SVP，MANJUNATHA BK，2015. Studies on hydrocarbon degradation by the bacterial isolate Stenotrophomonas rhizophila （PM-1） from oil spilled regions of Western Ghats of Karnataka [J]. Sci Technol Art Res J，4（3）：139.

KIM M，OH HS，PARK SC，et al.，2014. Towards a taxonomic coherence between average nucleotide identity and 16S rRNA gene sequence similarity for species demarcation of prokaryotes [J]. Int J Syst Evol Microbiol，64：346-351.

LI Y，2012. Isolation and screening anti-viral actinomycetes from three mangrove [D]. Haikou：Hainan University.[李逾，2012. 三種紅樹植物共附生放線菌的分離及其抗病毒活性菌株的篩選 [D]. 海口：海南大學.]

LI FN，PAN Z，TUO L，et al.，2017. Studies on the diversity and novelty of endophytic actinobacteria isolated from mangrove plants collected in Macao [J]. Chin J Antibiot，42（4）：284-293. [李飛娜，潘臻，庹利，等，2017. 澳門紅樹林植物內生放線菌多樣性及新穎性研究 [J]. 中國抗生素雜志，42（4）：284-293.]

LIN P，1997. Mangroves ecosystem from China [M]. Beijing：Science Pres. [林鵬，1997. 中國紅樹林生態系 [M]. 北京：科學出版社]

LI M，YI XX，YANG CN，et al.，2018. Study on diversity and anti-aging activity of endophytic actinobacteria from associated mangrove plants collected from the west coast of Hainan [J]. Guihaia. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/45.1134.Q.20180802.1511.002.html. [李蜜，易湘茜，楊彩妮，等，2018. 海南西海岸紅樹林伴生植物內生放線菌多樣性及其延緩衰老活性初篩 [J/OL]. 廣西植物. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/45.1134.Q.20180802.1511.002.html.]

LI JY，ZHOU WH，LI F，et al.，2017. Diversity of cultivated marine bacteria and antibacterial activity of endophytic bacterial in Rhizophora stylosa [J]. Guihaia，37（3）：308-314. [李家怡，周文紅，李菲，等，2017. 紅海欖內生細菌多樣性及其抑制魚類致病菌活性研究 [J]. 廣西植物，37（3）： 308-314.]

LI F，GAO CH，ZHU LB，et al.，2016. Diversity and cytotoxic activity of endophytic bacteria isolated from Sonneratia apetala of Maowei Sea [J]. Acta Microbiol Sin，56（4）：689-697. [李菲，高程海，竺利波，等，2016. 茅尾海無瓣海桑內生細菌多樣性及其細胞毒活性 [J]. 微生物學報，56（4）：689-697.]

LI F，GAO CH，YU L，et al.，2017. Diversity of endophytic bacteria isolated from Kandelia candel and its in-vitro activity against Ustilago scitaminea Sydow [J]. Chin J Antibiot，42（4）：318-320. [李菲，高程海，余煉，等，2017. 秋茄內生細菌多樣性及抑制甘蔗黑穗霉菌活性研究 [J]. 中國抗生素雜志，42（4）：318-320.]

LI WJ，XU P，XU LH，et al.，2003. Actinomycetes resources form the extreme environment [J]. Microbiol Chin，30（4）：125-127. [李文均，徐平，徐麗華，等，2003. 極端環境中的放線菌資源 [J]. 微生物學通報，30（4）：125-127.]

LIU YH，WANG H，HU XK，2016. Recent advances in the biodegradation of hydrocarbons by Acinetobacter species [J]. Microbiol Chin，43（7）：1579-1589. [劉玉華，王慧，胡曉珂，2016. 不動桿菌屬（Acinetobacter）細菌降解石油烴的研究進展 [J]. 微生物學通報，43（7）：1579-1589.]

LIAO BW，ZHANG QM，2014. Area，distribution and species composition of mangroves in China [J]. Wetl Sci，12（4）：436-440. [廖寶文，張喬民，2014. 中國紅樹林的分布、面積和樹種組成 [J]. 濕地科學，12（4）：436-440.]

NGUYEN NT，2018. Acinetobacter soli SP2 capable of high-efficiency degradation of food emulsifier polysorbate 80 [J]. Curr Microbiol，75（7）：896-900.

PETRASCHECK M，YE X，BUCK LB，2007. An antidepressant that extends lifespan in adult Caenorhabditis elegans [J]. Nature，450（7169）：553-556.

QIN M，YU QW，ZHU LB，et al.，2016. Diversity of epiphytic bacteria of three species of gracilaria and their bacteriostatic activities [J]. J S Agric，47（11）：1966-1973. [覃媚，于清武，竺利波，等，2016. 三種江蘺共附生細菌多樣性及抑菌活性分析 [J]. 南方農業學報，47（11）：1966-1973.]

SHEN MX，CHEN G，TIAN L，et al.，2011. Cyclo-dipeptide metabolites from marine bacterium Pantoea agglomerans [J]. J Shenyang Pharm Univ，28（5）：350-354. [沈明曦，陳剛，田黎，等，2011. 海洋細菌成團泛菌（Pantoea agglomerans）中環二肽類代謝產物的研究 [J]. 沈陽藥科大學學報，28（5）：350-354.]

WEI YZ，ZHANG YQ，ZHAO LL，et al.，2010. Isolation，screening and preliminary identification of endophytic actinobacteria from mangroves at Shankou of Guangxi Province [J]. Microbiol Chin，37（6）：823-828. [魏玉珍，張玉琴，趙莉莉，等，2010. 廣西山口紅樹林內生放線菌的分離、篩選及初步鑒定 [J]. 微生物學通報，37（6）：823-828.]

WALSH PS，METZGER DA，HIGUCHI R，1991. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material [J]. Biotechniques，10（4）：506-513.

YUAN XW，YANG RL，2009. Isolation and identification of one marine actinomycete strain exhibiting antitumor activity [J]. Microbiol Chin，36（1）：78-83. [袁獻溫，楊瑞麗，2009. 一株具有抗腫瘤活性的海洋放線菌的分離和鑒定 [J]. 微生物學通報，36（1）：78-83.]

YAN DM，WANG W，LI M，et al.，2018. Diversity of rhizospheric bacteria and its inhibition activity from Sonneratia apetala in Maowei Sea [J]. J S Agric，49（6）：1095-1101. [顏棟美，王偉，李蜜，等，2018. 茅尾海無瓣海桑根際土壤細菌多樣性及抑菌活性分析 [J]. 南方農業學報，49（6）：1095-1101.]

ZENG EK，SUN YH，DUAN L，et al.，2012. Aging of Chinese population and science of aging [J]. Chin J Soc Med，29（6）：388-389. [曾爾亢，孫煜昊，段凌，等，2012. 我國人口老齡化與衰老科學 [J]. 中國社會醫學雜志，29（6）：388-389.]

ZHOU SQ，HUANG XL，HUANG DY，et al.，2010. A rapid method for extracting DNA from a ctinomycetes by Chelex-100 [J]. Biotechnol Bull，26（2）：123-125. [周雙清，黃小龍，黃東益，等，2010. Chelex-100快速提取放線菌DNA作為PCR擴增模板 [J]. 生物技術通報，26（2）：123-125.]

（責任編輯 周翠鳴）