翼狀胬肉形成相關基因的表達研究

趙 牧，王 宇，2

（1.攀枝花學院 醫學院，四川 攀枝花617000；2.攀枝花學院附屬醫院，四川 攀枝花617000）

翼狀胬肉是一種常見的眼表疾病，局部球結膜纖維血管組織呈三角形膜樣增生侵犯角膜而引發形成，其酷似昆蟲翅膀而得名。紫外線、風沙、過敏等因素是引發該病的主要外部因素，發病機理涉及解剖學、病理學、分子生物學、免疫學及病毒學等多個領域，但現在仍然存在爭議［1-2］。目前，翼狀胬肉的治療仍以手術為主，但術后復發率較高，具有某些腫瘤樣特性，所以現在很多學者將其作為一種良性腫瘤樣病變進行研究，取得了一些研究成果［3］。

本研究通過前期構建的翼狀胬肉cDNA文庫，找到一些在翼狀胬肉組織中表達的基因，通過采用實時熒光定量逆轉錄PCR技術比較這些基因在翼狀胬肉與正常結膜組織中的表達差異，從分子水平上探討翼狀胬肉形成的病因，為其進一步的預防和治療奠定基礎。

1 資料和方法

1.1 一般資料

32例翼狀胬肉組織標本隨機取自攀枝花學院附屬醫院的眼科手術病人，其中男18例，女14例，年齡為38-72歲，平均年齡49.2歲，所有患者均無其他結膜疾患。同時將患者眼角膜上緣上方的切緣中的正常球結膜組織作為對照，手術取樣后迅速置于液氮中，-80℃保存。

1.2 主要儀器和試劑

總RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒購于北京天根生化科技有限公司，RNase-free DNase I購于Fermentas公司，熒光定量PCR試劑盒、凝膠成像系統和PCR儀購于美國伯樂公司，微量紫外分光光度計購于美國貝克曼公司。PCR引物由蘇州金唯智公司合成。

1.3 引物設計

使用Primer5.0軟件設計特異性定量PCR引物，在NCBI數據庫中進行引物特異性比對，引物具體信息見表1。

表1 PCR引物序列

1.4 RNA提取和反轉錄

按照微量樣品總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）的使用說明操作提取翼狀胬肉組織的總RNA，然后用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測總RNA的完整性和純度。為了消除基因組DNA的污染，用RNase-free DNase I對總RNA進行處理，最后按照反轉錄試劑盒的說明進行反轉錄得到cDNA。

1.5 熒光定量逆轉錄PCR反應

以人18SrRNA為內參基因，用qRT-PCR對基因表達進行檢測，反應體系為25μL：1μL cDNA，12.5μL SYBR Green mixture，上下游引物（10μM）各0.5μL，10.5μL水。反應體系為：95℃預變性10 min；然后95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s進行42個循環，添加熔解曲線，確保擴增產物的特異性，每個樣品重復測定3次。采用2-ΔΔCt法對qRT-PCR得到的試驗數據進行分析。

1.6 統計學分析

各項數據以均數和標準差（x±s）表示，兩組樣本間采用t檢驗分析。

2 結果

2.1 總RNA的鑒定

從翼狀胬肉及正常球結膜組織中抽提總RNA，經凝膠電泳檢測，RNA無明顯降解；紫外分光光度計檢測，之間，表明RNA純度較高，可用于后續實驗。

2.2 基因的表達檢測

通過檢測干擾素誘導蛋白（IFI27）、三葉肽因子3（TFF3）、橋粒斑蛋白（Pkp2）、Rho GTPase激活蛋白（RhoGAP）、活性氧調節因子（ROMO1）和環氧化酶2（COX-2）的表達水平，發現這些基因在翼狀胬肉組織中的表達明顯高于正常球結膜組織（P＜0.01）（圖1）。

3 討論

翼狀胬肉的發病機制非常復雜，環境因素的刺激與翼狀胬肉的發生密切相關，尤其是海員、漁民、沙石工人長期受到強烈光線照射、風沙、煙塵等因素的影響，使角膜緣部結膜血管或結膜組織發生非感染性慢性炎癥，最終造成彈性纖維與膠原纖維的增生和變性，這是翼狀胬肉較為突出的病理改變，同時大量的基因突變也會啟動正常結膜及纖維血管組織過度增殖而引起翼狀胬肉［4］。現在研究表明長期接觸生產性毒物如氟、砷、二氧化硫和粉塵，也會導致翼狀胬肉［5］。

圖1 差異表達基因的qRT-PCR分析

本研究通過對上述基因的研究，可以發現翼狀胬肉也是一種與血管生成、纖維生成和炎性因子相關的疾病。干擾素誘導蛋白（IFI27）是干擾素誘導蛋白200家族的成員之一，參與了多種細胞活動，包括炎癥反應、免疫反應、細胞增殖，細胞凋亡等，已有研究表明干擾素誘導蛋白主要介導Thl型炎癥反應，其家族成員的異常表達與多種腫瘤的發生密切相關［6-7］。橋粒斑蛋白（Pkp2）是橋粒的主要蛋白成分之一，起連接細胞內中間絲和橋粒的作用，它不僅與離子轉運相關通道有關，而且通過免疫組化實驗發現其在鱗癌、腺癌等多種癌細胞內進行表達，已成為腫瘤檢測的標記物［8］。三葉肽因子3（TFF3）是一類富含半膀氨酸的小分子肽，在外周血中能夠穩定測定，是一種重要的信息分子。它與黏液糖蛋白相互作用，可誘導上皮細胞遷移，促使損傷后黏膜快速修復；TFF3可能通過酪氨酸或雙重特別性磷酸酶活性的激活調節細胞內信息通道，能抑制有絲分裂原激活的蛋白激酶和信息相關蛋白激酶的活性，從而參與信號傳導，TFF3也可能為角膜內的浸潤提供傳導信號［9-10］。Rho GTPase激活蛋白（RhoGAP）是Ras超家族的成員之一，具有GTPase酶活性。它是一種多信號調控分子，可以調節多種細胞功能并且能和其他蛋白相互作用，參與細胞的多項生命活動，如肌動蛋白細胞骨架的重構、細胞黏附和運動、囊泡運輸、基因表達和細胞周期的調控等［11-12］。由于Rho GTPase在細胞信號轉導中有著重要的作用，對于揭示信號轉導機制和臨床上多種疾病的發病機制具有重要的指導意義。活性氧調節因子（ROMO1）是一種新型的線粒體跨膜蛋白，可以控制細胞內活性氧（ROS）的水平，對細胞的增殖產生決定性作用，因此可以通過誘導線粒體產生ROS發揮致癌作用［13］。ROS不僅可以引起DNA的氧化損傷，還能通過化學機制產生環氧化酶2（COX-2）。COX-2由604個氨基酸組成，是一種“應答基因”，正常狀態下在多數組織中不表達，在各種誘導因子的刺激下進行表達，調節細胞的增殖與分化，它也是促進翼狀胬肉形成的一種重要誘導酶［14］。

本研究通過發現一些可能參與翼狀胬肉形成的基因，為從分子學角度深入研究翼狀胬肉的發病機制提供了幫助。下一步可以進行深入研究，能否將上述基因作為翼狀胬肉早期診斷的分子標志物，同時可以作為治療的分子靶標，利用RNA干擾技術阻礙其表達，達到治療的目的。