重度子癇前期胎盤組織中miR-210及GPD1L的相關性分析

付 晗，崔世紅，劉 靈，職云曉，陳 娟，呂曉峰，劉金金，閆書君

子癇前期（preeclampsia，PE）是妊娠期特有的一種嚴重并發癥，嚴重的PE對孕產婦及圍產兒的健康產生極大的威脅，但其病因及發病機制尚不明確。胎盤損傷是子癇前期發病的根源，其中胎盤缺血缺氧是子癇前期發病的關鍵環節［1］。近年大量研究表明，缺氧誘導因子-1（Hypoxia-induciblefactor-1，HIF-1）在低氧狀態下影響子宮螺旋小動脈的形成及滋養細胞的增殖、分化和侵襲能力，參與子癇前期的發病機制過程。

microRNAs（miRNAs）是近年來發現的在真核細胞中廣泛存在的非編碼單鏈小分子RNA家族，通過對靶mRNA的3’非翻譯區 （3’untranslated region，3’UTR）互補配對結合抑制靶mRNA的表達，在細胞的增殖、分化及凋亡等生物學過程中發揮重要作用［2］。研究表明，作為細胞在缺氧條件下特異性表達上調最顯著的miRNA分子miR-210在子癇前期胎盤中存在著明顯的表達上調，但其在PE中的發病機制尚在進一步研究探索階段［3］。在腫瘤等低氧性疾病中證實［4］，甘油三磷酸脫氫酶-1-Like基因 （GPD1LmRNA）存在與miR-210靶向結合的3，UTR，受其靶向調控抑制，而GPD1L蛋白可以通過調節和維持脯氨酸氧化酶（PHD）的穩定性增強其羥化HIF-1的能力而促進HIF-1降解。但是在低氧條件下GPD1LmRNA的表達能力及GPD1L蛋白的調節能力受到抑制。這種調節機制在重度子癇前期（sPE）胎盤中是否發揮同樣的作用尚未見明確報道。因此該研究將著重分析miR-210、GPD1L及HIF-1α在重度子癇前期胎盤組織中的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月—2018年12月在鄭州大學第三附屬醫院產科住院并行剖宮產分娩的40例重度子癇前期孕婦為試驗組及40例年齡相差2歲以內產前檢查正常并行剖宮產分娩的健康孕婦為對照組。納入標準：所有孕產婦均為中國漢族、單胎妊娠；對照組剖宮產的標準：胎位異常、骨盆先天發育異常等無法經陰道分娩。排除標準：嚴重炎癥、自身免疫性疾病、慢性高血壓、子癇前期病史、糖尿病、甲狀腺疾病及慢性肝腎疾病病史等。重度子癇前期的診斷標準參照《婦產科學》第九版［5］；該研究經鄭州大學第三附屬醫院倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 試劑 HIF-1抗體：武漢三鷹（Cat.No.20960-1-AP）、GPD1L 抗體：成都正能（Cat.No.611326）、SP染色試劑盒：中杉金橋 （Cat.No.SP-9000）、All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit：GeneCopoeia （Cat.No.QP013）、All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit：GeneCopoeia （Cat.No.QP010）、All-in-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit：Gene Copoeia （Cat.No.QP006）、All-in-OneTMqPCR Mix：GeneCopoeia（Cat.No.QP001）

1.3 方法 胎盤娩出5 min內，立即在母體面四個象限的中央部位各取1塊約1 cm×1 cm×1 cm大小的胎盤組織（所取標本避免出血、梗死及鈣化灶等異常組織）用無菌生理鹽水反復沖洗。取其中任兩塊組織放入10%甲醛中固定48 h以上送病理科進行石蠟包埋并編號。另兩塊放入編號的滅菌EP管中在液氮中凍存24 h后放入-80℃冰箱內保存。

1.3.1 免疫組化法檢測胎盤組織中HIF-1蛋白及GPD1L蛋白的表達情況及其結果的判讀 石蠟包埋的標本切制成5μm厚的連續切片，然后逐一脫蠟、水化，封閉、抗原高溫修復、分別滴加HIF抗體（稀釋度 1∶100）及 GPD1L 抗體（稀釋度 1∶200），隨后加入生物素標記的二抗，0.04%DAB-H2O2顯色，經蘇木精一伊紅染色（HE）染色，無水乙醇梯度脫水，中性樹膠固定。以PBS代替一抗做陰性對照，用于驗證陽性切片為陽性對照。各步驟均嚴格按照試劑盒說明書步驟進行操作。采用光學顯微鏡（400倍）下判斷切片質量并進行評分，然后采用鏈霉卵白素一生物素法檢測系統進行檢測。請兩名對患者臨床情況一無所知的副高以上的病理科醫師觀察免疫組化染色后的組織并評分。陽性細胞判斷標準：根據胞漿染色情況和陽性細胞數來判定蛋白的表達水平。先按染色強度打分：無色-0分，淺黃色-1分，棕黃色-2分，棕褐色-3分；再按陽性細胞百分比打分：陽性細胞數≤10%為0分，10%～25%為1分，>25%～50%為 2分，>50%～75%為 3分，>75%為4分；以上兩結果相加為最后得分：染色強度分數×陽性細胞百分比≥2分為陽性，染色強度分數×陽性細胞百分比<2分為陰性。

1.3.2 實時熒光定量PCR（real-time PCR）法檢測胎盤組織中miR-210、GPD1LmRNA及HIF-1mRNA的表達水平 取適量胎盤組織樣本放于Trizol中研磨后提取總RNA，然后氯仿萃取、異丙醇沉淀、75%的乙醇洗滌、干燥RNA沉淀后用DEPC處理水溶解RNA沉淀，最后測RNA濃度和純度。進行反轉錄合成cDNA，PCR擴增引物由華大基因合成。陰性對照用水代替cDNA。miR-210的上游引物：5，-GGAGATCTGACCAGGTCATTTGCATAC-3’，下 游引物：5’-GGCCAACCGCGAGAAGATGTTTTTTTTT-3’；GPD1LmRNA 的上游引物：5’-TCGTTAGTTGTC

AGAATA-3’，下游引物：5’-TGTTAATCAGAAGAA TGTG-3’；HIF-1αmRNA 的上游引物：5’-CCGAGG AAGAACTATGAA-3’，下游引物：5’-GTTGGTTACT GTTGGTATC-3’。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參，GAPDH 的上游引物：5’-CTCTGGTAA AGTGGATATTGT-3’， 下游引物：5’-GGTGGAAT CATATTGGAACA-3’。擴張反應條件：95℃預變性10 min，95℃變性 30 s，58℃退火，72℃延伸 30 s，40個循環。根據擴增結果獲得到每個樣本中檢測基因的 Ct值，采用 2-ΔΔCt法計算 miR-210、GPD1LmRNA及HIF-1mRNA的相對表達量。

1.4 統計學分析 應用SPSS 21.0軟件進行統計學分析，定性資料采用χ2檢驗及Fisher精確檢驗；正態分布的計量資料采用（x±s），組間比較采用兩獨立樣本的t檢驗。相關性分析采用Spearman相關分析；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 兩組孕婦的年齡差異無統計學意義；孕周、收縮壓及舒張壓比較差異有統計學意義。見表1。

2.2 兩組胎盤組織中HIF-1及GPD1L蛋白的表達水平 與對照組相比，重度子癇前期胎盤組織中GPD1L 蛋白低表達，陽性率（32.5%，P＜0.05），HIF-1蛋白高表達，陽性率（65%，P＜0.05），見表 2 及圖 1、2。

表1 兩組孕婦一般情況比較（x±s）

表2 兩組胎盤組織中HIF-1蛋白的表達比較［例（%）］

下圖1、2：付 晗，崔世紅，劉 靈，等.重度子癇前期胎盤組織中miR-210及GPD1L的相關性分析（正文297～300，306頁）

圖1 各組胎盤組織中GPD1L蛋白的表達（×400倍）

圖2 各組胎盤組織中HIF-1蛋白的表達（×400倍）

2.3 兩組胎盤組織中miR-210、GPD1LmRNA及

HIF-1mRNA的表達水平 重度子癇前期胎盤組織中miR-210及HIF-1mRNA的表達水平明顯高于對照組；而GPD1L mRNA的表達量明顯低于對照組（P值均＜0.001），見表3。重度子癇前期胎盤組織中miR-210的表達水平與GPD1L mRNA的表達水平存在明顯的負相關（r=-0.911，P＜0.001）。

3 討論

子癇前期是妊娠20周以后出現的以高血壓、蛋白尿為主要臨床表現的妊娠期特發性疾病，嚴重威脅母嬰生命健康。目前普遍認為，滋養細胞浸潤能力受損及子宮螺旋小動脈重鑄不足導致胎盤缺血缺氧是導致子癇前期發病的關鍵環節［6］。

HIF-1是由HIF-1及HIF-1β組成的一個異源性二聚體，其中HIF-1具有啟動基因表達活性的能力，受氧濃度的調節，參與機體的缺氧應答反應［7］。大量研究證實，HIF-1參與子癇前期相關的低氧反應基因表達調節，如血管內皮生長因子（VEGF）及其受體（sFlt-1）、轉化生長因子（TGF-β3）、胎盤生長因子 （PIGF）、腫瘤壞死因子、胰島素生長因子（IGF-1）、內皮素-1（ET-1）及糖酵解有關的酶等，進而影響子癇前期胎盤新生血管的形成及滋養細胞的增殖與分化能力［8-10］。該研究結果顯示：HIF-1mRNA在重度子癇前期胎盤組織中高表達且HIF-1蛋白表達的強陽性率明顯高于對照組。

GPD1L基因位于3p22.3染色體上，其編碼的蛋白參與能量的產生、滲透調節、細胞的生長發育及凋亡等生物學過程［11，12］。 研究證實［4，13］，PHD 在正常氧分壓條件下羥化HIF-1亞基上的氧依賴降解區 （oxygen dependent degradation domain，ODD）的脯氨酸，羥化后HIF-1易與腫瘤抑制蛋白（von hoppel-lindauprontein，pVHL）結合進而被泛素依賴的蛋白水解酶復合體酶解。缺氧時，PHD的表達被抑制，使得HIF-1無法被羥化降解而大量聚集，則累積的HIF-1與穩定表達的HIF-1β結合形成HIF-1進入細胞核啟動細胞內下游缺氧反應基因的轉錄而發揮生物學作用。本研究結果顯示：與對照組相比，在重度子癇前期患者胎盤組織中GPD1LmRNA低表達且GPD1L蛋白的陽性率明顯降低，而HIF-1蛋白表達的陽性率明顯增加。可見HIF-1蛋白的累積可能同時表現在降解途徑被抑制及表達途徑增強，由此可以推測GPD1L蛋白在胎盤中可能同樣發揮維持PHD穩定性的作用進而調節HIF-1的含量。

表3 兩組胎盤組織中miR-210、GPD1LmRNA及HIF-1RNA的表達比較

miRNAs家族具有廣泛的基因調節能力，參與多種信號調節通路而發揮其生物學作用。目前已有大量研究表明，miR-210在缺氧條件下表達明顯上調，進而調控靶基因的表達而參與新生血管形成、線粒體的新陳代謝、細胞的增殖和DNA損傷修復能力等，從而參與疾病發病過程［14］，但在子癇前期重度研究尚處于起始階段。研究證實，在子癇前胎盤組織中基因同源型 A9（HOXA9）、碟素 A3（ephrin3，EFNA3）及 KCMF 基因受 miR-210 靶向調控參與滋養細胞的增殖、分化、發育、血管重鑄及滋養細胞線粒體的能量代謝等［15，16］。該研究結果顯示：miR-210在sPE中表達明顯上調，提示胎盤處于缺氧狀態及miR-210可能通過調控下游基因的表達參與重度子癇前期的低氧應答調節；此外miR-210表達水平與 GPD1LmRNA表達水平存在明顯的負相關，提示GPD1LmRNA在重度子癇前期胎盤中可能是miR-210的靶基因并受其靶向抑制。

綜上所述，miR-210與GPD1LmRNA的表達水平存在明顯的負相關，GPD1L蛋白的表達與HIF-1蛋白的表達水平明顯相反。因此推測miR-210可能通過抑制GPD1LmRNA的表達上調HIF-1蛋白的濃度而參與重度子癇前期的發病機制過程。目前對于miRNA在子癇前期中的研究尚處于探索階段，此研究結果可能為其在子癇前期的研究提供一個新的思路。