不同程度宮頸癌前病變患者陰道菌群的群落差異分析

劉 星

宮頸癌為我國女性較為常見的惡性腫瘤，其發病率在所有女性惡性腫瘤中位居第二，在生殖系統惡性腫瘤中位居首位，隨著人們生活方式及生活環境的不斷改變，宮頸癌的發病率正呈逐年升高趨勢，嚴重威脅女性生命健康［1，2］。 宮頸癌前病變（cervical intraeptithelial neoplasia，CIN）主要是指女性具有癌變風險，但臨床尚未診斷為原位癌的一類宮頸異常增殖性病變，極有可能發展為宮頸癌［3］。眾所周知，女性陰道菌群在陰道微環境穩定保護過程中起著至關重要的作用，越來越多的學者認為，陰道微生物可能在宮頸病變發生過程中發揮著關鍵性作用［4］。然而，上述觀點尚存在一定的爭議，既往研究中主要是依靠采集女性陰道分泌物涂片與陰道功能性指標等途徑評價陰道微生態，然而實際工作中受多種因素的影響，可能會對實際結果產生影響。鑒于此，該文通過對比不同程度宮頸癌前病變患者陰道菌群群落差異，旨在為臨床宮頸癌前病變的防治提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取筆者所在醫院2017年2月—2019年2月收治的宮頸癌前病變患者117例作為研究對象。年齡 23～58 歲，平均（39.84±5.22）歲；文化程度：初中及初中以下50例，高中及高中以上67例。將其按照患者宮頸癌前病變程度的差異分成CINⅠ組39例、CINⅡ組34例以及CINⅢ組44例。另取同期接受體檢的健康女性40名作為對照組，年齡 24～59 歲，平均（39.88±5.25）歲；文化程度：初中及初中以下16例，高中及高中以上24例。兩組上述指標比較，差異不顯著（P＞0.05），均衡可比。納入標準：（1）宮頸癌前病變患者均與《宮頸癌前病變以及宮頸癌檢查教程》［5］中所制定的相關診斷標準相符；（2）均為已婚女性；（3）入院前 1個月內為接受抗生素以及陰道沖洗藥物干預；（4）年齡≥18周歲。排除標準：（1）近1周內有性生活、陰道異常分泌物以及流血者；（2）合并泌尿生殖器炎癥者；（3）心、肝、腎等重要臟器發生病變者；（4）具有長期使用皮質類固醇以及免疫抑制劑史者；（5）意識障礙或伴有精神疾病者；（6）正參與其他研究者。研究對象知情同意，且醫院倫理委員會已批準該研究。

1.2 研究方法 （1）以無菌棉拭子在所有受試者陰道后穹窿處轉動15 s左右，待其充分吸收受試者陰道內分泌物后置入干燥無菌試管內，將采集好的標本放置在冰箱中保存，用于細菌基因組提取。細菌基因DNA提取試劑盒購自德國，具體操作嚴格按試劑盒說明書進行。以稀釋提取的基因組作為模板，引物序列如下：5’-ACTCCTACGGGAGGCAG GAG-3’，5’ -GGACTACHVGGTWTCATAAT-3’。PCR產物以瓊脂糖凝膠實施電泳檢測，并按照其PCR產物濃度予以等量混合。生物信息學分析以MiSeq軟件的默認指數對其原始測序數據予以測定，在去除接頭數列以及低質量數列的預處理，通過其命令對標本菌群的主成分分析和不同組件群落結構以及菌群差異。（2）血清炎癥因子水平檢測：分別于所有受試者清晨空腹狀態下，采集靜脈血5 ml，以3000 r/min作為離心條件進行時長為10 min的離心處理，取上層血清保存在-80℃冰箱中待檢。檢測方式為酶聯免疫吸附法，具體操作嚴格遵從試劑盒說明書進行，相關試劑盒均購自上海康郎生物科技有限公司。

1.3 觀察指標 比較四組人員多樣性指數，陰道菌群類型，陰道菌群檢出情況，血清炎癥因子水平。

1.4 統計學方法 以SPSS 20.0軟件進行數據分析，計量資料以（x±s）表示，計數資料以［n（%）］表示。

2 結果

2.1 四組人員多樣性指數對比 CINⅠ組Chao指數、ACE指數相較于CINⅡ組、CINⅢ組、對照組明顯更高（P＜0.05）；而四組在辛普森指數、香農指數方面比較，差異無統計學意義（均P＞0.05），見表1。

表1 四組人員多樣性指數對比（x±s）

2.2 四組陰道菌群類型對比 CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組、對照組的陰道菌群類型比較，差異無統計學意義，見表2。

表2 四組陰道菌群類型對比［例（%）］

2.3 四組陰道菌群檢出情況對比 CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組乳酸桿菌檢出率均顯著低于對照組，且CINⅡ組、CINⅢ組解脲支原體、衣原體檢出率亦顯著高于對照組；四組霉菌以及滴蟲檢出率對比差異均不明顯，見表3。

表3 四組陰道菌群檢出情況對比［例（%）］

2.4 四組血清炎癥因子水平對比 CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組血清IL-2水平均顯著低于對照組，IL-4水平顯著高于對照組，且CINⅡ組、CINⅢ組血清IFN-γ水平顯著低于對照組，見表4。

表4 四組血清炎癥因子水平對比（例，x±s）

3 討論

陰道微生態環境主要是由內分泌調節、微生態菌群、解剖結構組成，相關研究表明，每個育齡女性可分離6～8種微生物，且以細菌為主，并會隨著年齡以及妊娠等變化隨之發生演變［6-8］。作為一種生物屏障，陰道菌群存在于陰道黏膜上皮以及陰道分泌液中，可發揮防御外襲菌侵入，激活宿主免疫反應以及維持陰道環境等多種功效［9］。宮頸暴露在陰道中，正常情況下陰道微環境處于平衡狀態，一旦該平衡被打破，則會促使微生物入侵，繼而引發宮頸病變，對女性的生命健康安全造成嚴重威脅［10］。

該文結果顯示，CINⅠ組Chao指數、ACE指數相較于CINⅡ組、CINⅢ組、對照組明顯更高；而四組在辛普森指數、香農指數方面對比均不明顯，說明了CINⅠ患者相較于健康女性，其陰道部分菌群豐度增加。此外，CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組乳酸桿菌檢出率均顯著低于對照組，且CINⅡ組、CINⅢ組解脲支原體、衣原體檢出率亦顯著高于對照組。這在韓華等人的研究中得以證實［11］：CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組以及宮頸癌組的乳酸桿菌檢出率均顯著低于對照組。究其原因，解脲支原體是人乳頭瘤病毒促進宮頸病變的重要輔助因子，和人乳頭瘤病毒的持續感染以及宮頸早期細胞學改變存在密切相關。而衣原體的代謝產物可促使宮頸局部出現pH值的升高，進一步對陰道局部免疫保護屏障造成破壞，繼而增加了人乳頭瘤病毒的易感性，最終促進了宮頸病變的發生、發展。正常而言，女性陰道菌群中主要以乳酸桿菌為主，其在保護女性陰道微生態平衡以及抑制病原微生物生長，提高女性陰道局部抗感染以及抗腫瘤能力方面具有極其重要的作用。乳酸桿菌可保護女性陰道黏膜上皮細胞不會遭受病原菌侵害，同時分泌出相應的物質促進生物膜的形成，繼而發揮抑制病原菌黏附和侵襲的作用。而隨著乳酸桿菌的下降，會導致女性陰道微生態平衡破壞，宮頸上皮對高危型人乳頭瘤病毒的易感性提高，從而促進了宮頸病變的發生、發展。IFN-γ主要是活化的Th細胞以及NK細胞合成、分泌，促進Th1細胞的發育成熟，同時對Th2細胞的活化產生抑制作用，參與免疫調節過程。IL-2則是機體免疫應答核心因子之一，其活性高低和宮頸局部免疫狀態直接相關，隨著IL-2表達的增多可提高巨噬細胞的抗腫瘤活性。而IL-4主要是由激活的Th2細胞分泌，可促使Th細胞朝著Th2細胞方面分化，具有抑制殺傷細胞激活的功能［12］。而該文結果發現了CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組血清IL-2水平均顯著低于對照組，IL-4水平顯著高于對照組，且CINⅡ組、CINⅢ組血清IFN-γ水平顯著低于對照組（均 P＜0.05）。 這提示了炎性因子 IFN-γ、IL-2 以及IL-4可能是宮頸癌前病變的影響因子，可能通過參與宮頸癌前病變的發生、發展過程［13-15］。

綜上所述，不同程度宮頸癌前病變的患者陰道菌群多樣性以及類型均和健康女性差異不大，僅CINⅠ患者的陰道部分菌群豐度增加。而解脲支原體、衣原體增加與乳酸桿菌減少以及血清IFN-γ、IL-2、IL-4水平異常改變，可能在宮頸癌前病變的發生、發展過程中起著至關重要的作用。