天智顆粒對慢性腦缺血大鼠腦組織Drebrin表達的影響

李 林

慢性腦缺血起病隱匿，早期癥狀容易受忽視，最終可導致學習記憶功能障礙、腦白質損傷、神經元變性等，嚴重影響患者生活質量，加重家庭經濟負擔，但慢性腦缺血早期是可逆的，因此及時發現疾病并在發病早期給予干預可阻止疾病進展。近年來大部分研究顯示，中藥對腦血管病所致的大腦功能障礙有很好的治療效果，其中天智顆粒是根據我國古老的中藥組方天麻鉤藤飲研制的一種藥物，臨床研究顯示天智顆粒有較好地改善認知功能的效果［1］。但目前對于天智顆粒改善大腦功能的機制研究尚不充分。因此，筆者通過雙側頸總動脈永久性結扎（2VO）建立大鼠慢性腦缺血模型，通過水迷宮實驗觀察天智顆粒對慢性腦缺血大鼠學習記憶能力影響，免疫組化方法檢測天智顆粒對腦組織Drebrin的表達影響，探討天智顆粒改善大腦功能的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 SPF級健康成年無視力缺陷的Wistar大鼠80只，雌雄不限，體重300 g左右，由鄭州大學醫學院動物中心提供。隨機分為4組：正常對照組，假手術組，模型組，天智顆粒治療組，每組20只。

1.2 試劑與儀器 天智顆粒（宛西制藥有限公司）、山羊抗Drebrin多克隆抗體（Santa Cruz公司）、山羊PV-9003免疫組化檢測試劑盒（北京中杉金橋生物有限公司）、濃縮型DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物有限公司）、Morris水迷宮儀 （中國醫學科學院藥物研究所）等。

1.3 動物模型制作 雙側頸總動脈永久性結扎（2VO）建立大鼠慢性腦缺血模型，大鼠手術前禁食12 h，禁水4 h，腹腔注射10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）麻醉，絲線雙重結扎雙側頸總動脈。術后大鼠均置于原通風的動物房喂養，給予足夠的食物和水。假手術組不結扎雙側頸總動脈，余處理同模型組大鼠。正常對照組不予手術處理。

1.4 給藥方法 治療組于手術后次日開始每天給予天智顆粒（5 g/kg）灌胃，模型組和假手術組分別給予蒸餾水（5 g/kg）灌胃，正常對照組不作任何處理。

1.5 大鼠學習記憶能力檢測 各組大鼠在灌胃4周后用Morris水迷宮實驗進行學習記憶功能檢測。Morris水迷宮實驗包括定位航行試驗和空間探索實驗兩部分。其中定位航行試驗歷時5 d，每天訓練4次，大鼠尋找到隱藏在水面下的可移動平臺的時間稱為逃避潛伏期（escape latency）。水迷宮的平臺位于西南象限，每次采用不同的入水點，每次訓練120 s。若大鼠在120 s內不能找到平臺，則將其誘導到平臺上停留10 s；若大鼠在規定時間內找到平臺，則讓其在平臺上停留10 s，結束一次訓練。各組大鼠訓練5 d，分別記錄第5天每只大鼠的逃避潛伏期進行統計學分析。大鼠的逃避潛伏期越短說明大鼠的學習記憶功能越好。

空間探索實驗是在定位航行試驗后去除平臺，然后任意選擇一個入水點將大鼠放入水池中，記錄大鼠在一定時間內的游泳軌跡，檢測大鼠對原來平臺位置的記憶能力。第5天進行空間探索實驗，撤去平臺，記錄120 s內大鼠穿越原來平臺位置的次數。大鼠穿越原來平臺區的次數越多說明大鼠的學習記憶功能越好。

1.6 免疫組化染色 各組大鼠學習記憶功能檢測結束后，常規灌注取大腦組織，多聚甲醛固定，石蠟包埋切片。按PV免疫組化操作。陰性對照由PBS代替一抗。每只動物取5張切片，每張切片高倍鏡下選取4個不同視野，計數每一個視野中的陽性細胞數，計算平均數。

1.7 讀片及統計學分析 所有實驗數據以（x±s）表示，用SPSS 21.0統計軟件進行數據處理，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較應用LSD法，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠學習記憶能力檢測結果 統計結果顯示，定位航行實驗顯示，與正常對照組逃避潛伏期相比，假手術組大鼠變化差異無統計學意義（P＞0.05）；與正常對照組大鼠相比，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長，差異有統計學意義（P＜0.05），說明模型組大鼠學習記憶功能明顯受損；與正常對照組相比，治療組大鼠逃避潛伏期明顯延長，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組相比較，治療組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，差異有統計學意義（P＜0.05），提示天智顆粒有效改善大鼠的學習記憶功能。見表1。

表1 各組大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期比較（x±s）

空間探索實驗顯示，正常對照組與假手術組大鼠固定時間內穿越原平臺的次數均較多；與正常組比較，模型組大鼠穿越平臺的次數明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組相比較，治療組穿越平臺的次數增多，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠Morris水迷宮穿越平臺次數比較（x±s）

2.2 大鼠腦組織Drebrin免疫組織化學結果Drebrin免疫組化陽性細胞為胞質中棕黃色顆粒，主要分布在軸突和樹突中。正常對照組及假手術組大鼠腦組織中Drebrin陽性細胞均較多，與正常組比較，假手術組大鼠腦組織中Drebrin陽性細胞無變化，差異無統計學意義（P＞0.05）；與正常組比較，慢性腦缺血模型組的Drebrin陽性細胞明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組相比較，治療組表達Drebrin的陽性細胞數增多，差異有統計學意義（P＜0.05）。 見圖 1、表 3。

下圖1：李 林.天智顆粒對慢性腦缺血大鼠腦組織Drebrin表達的影響（正文356～359，362頁）

圖1 各組大鼠腦Drebrin免疫組化染色結果（DAB染色，×200）

表3 各組大鼠腦組織Drebrin陽性細胞數比較（x±s）

3 討論

大腦發育調節蛋白（Drebrin），主要有Drebrin A（成年型）和Drebrin E（胚胎型）兩種亞型，是樹突棘纖維狀肌動蛋白（F-actin）的固有結合蛋白之一，在腦內高度表達。Drebrin介導F-actin和神經微管的相互作用，調控F-actin的分布，調節肌動蛋白骨架的結構形態［2］，同時Drebrin調控軸突細胞骨架結構，促進軸索側枝的形成［3］。Drebrin的表達也可以減少 Ca2+內流，避免 Ca2+超載引起樹突棘結構破壞［4］。在神經元發育過程中抑制Debrin A的表達，會抑制F-actin和PSD-95的聚集，進而抑制樹突棘的形成［5］。如果在神經元發育時期抑制Drebrin A表達，將導致樹突棘的成熟障礙及樹突棘的形態和數目異常［6］。成熟神經元細胞過表達Drebrin A引起樹突棘的伸長［7］。Kreis等的研究發現Drebrin基因敲除神經元樹突棘的易損性是增加的［8］。抑制發育中海馬神經元Drebrin A表達，引起絲狀偽足密度減小和寬度縮小［9］。在樹突棘中，Drebrin A的聚集促進肌動蛋白結構從線狀變為分枝狀［10］，而樹突棘形態的變化即突觸可塑性對于學習、記憶起著重要作用［11］。Drebrin和F-actin形成穩定的復合物是完成長時程突觸電位維持的關鍵，從而增強學習和記憶能力［12］。因此目前研究認為，Drebrin在樹突棘可塑性［13］和大腦高級 功能 如學 習 和記 憶 方面［14］起到重要作用，而且Drerbin在維持長時程記憶的生理過程中起到關鍵性的作用，其在神經元細胞遷移、突觸發生和突觸重塑也發揮著重要作用［15］。

慢性腦缺血因血管狹窄或血液動力學、血液流變學等因素導致腦血流量降低而出現腦慢性缺血缺氧改變。正常腦血流量約為50～55 ml/100 g·min，當腦血流量低于8 ml/100 g·min時，即可出現細胞膜破壞進而導致細胞死亡以及永久性神經壞死［16］。在急性腦缺血灶周圍樹突棘數量可減少38%［17］。大鼠幼年時藥物造成腦缺血損傷，6個月后發現大鼠腦組織樹突棘明顯減少［18］。阻斷大鼠一側大腦中動脈后，在缺血區域，樹突棘密度明顯降低［19］。大腦中動脈阻斷模型中腦缺血后7 d海馬CA1區Drebrin表達是減少的［20］。與正常對照組相比，全腦缺血模型大鼠海馬CA1區分枝狀樹突棘明顯減少、樹突棘密度明顯降低［21］。該研究發現大鼠慢性腦缺血后腦組織Drebrin表達減少，認知功能障礙，因此推測慢性腦缺血后Drebrin表達受抑制，導致樹突棘數量和形態改變，進而導致認知障礙。

慢性腦缺血的發病機制復雜，包括膠質細胞增殖活化、氧化應激反應、細胞凋亡、突觸改變、神經遞質紊亂等［22-24］，慢性腦缺血導致的腦損傷早期主要表現為認知功能損害，最終發展為持久或進展性的認知與神經功能障礙，因此在疾病早期針對發病機制給予干預，可更有效預防慢性腦缺血疾病進展。天智顆粒是由中藥天麻鉤藤飲加減制成的方劑，它的主要成分為：天麻、鉤藤、石決明、杜仲、桑寄生、茯神、首烏藤、槐花、梔子、黃芩、川牛膝、益母草。目前對天智顆粒組分之一天麻的提取物天麻素的研究較多，而其他成分研究甚少。體外實驗證明，天麻素減少興奮性氨基酸對神經細胞的損傷，促進神經干細胞的分化［25］。目前研究表明，天麻素具有抗氧化、清除自由基、抗興奮性毒性損傷、抑制缺氧時神經元細胞內Ca2+和NO的異常升高［26］、穩定細胞膜、抑制細胞凋亡等神經保護作用［27］和改善記憶力作用［28］。該研究結果顯示，與2VO模型組相比，天智顆粒治療組大鼠的行為學實驗證明天智顆粒治療后大鼠的學習記憶功能明顯改善，說明天智顆粒減少慢性缺血對大鼠腦神經元的損傷。與模型組相比，天智顆粒治療組大鼠腦組織Drebrin的表達升高，有統計學意義（P＜0.05），推測天智顆粒能促進慢性腦缺血大鼠神經元中Drebrin的表達，減少慢性缺血導致的神經元樹突棘的破壞，進而改善慢性腦缺血所致的認知障礙，但是天智顆粒的神經保護作用機制仍不清楚，并且作為一個古老的中藥復方制劑，具體發揮神經保護作用的成分亦不清楚，有待進一步的深入研究。