紅椎林中正紅菇生境的土壤肥力及真菌多樣性特征

任奎瑜，趙久成，郭 霜，王帥帥，張傳進，龐師嬋，楊尚東*

(1.廣西大學農學院植物科學國家級實驗教學示范中心，廣西 南寧 530004；2.廣西欽州市農業科學研究所，廣西 欽州 535000)

【研究意義】正紅菇(Russulavinosa)是真菌門(Eumycota)擔子菌亞門(Basidiomycotina)層菌綱(Hymenomycetes)擔子菌亞綱(Homobasidiomycetes)傘菌目(Agaricales)紅菇科(Russulaceae)紅菇屬(Russula)食用菌，又名紅椎菌、紅菌，是一種與楮樹、栲樹、椎木等的根系共生的菌根類真菌，在紅(白)椎林和特定的氣候、環境和土壤條件下才能生長[1-4]。正紅菇是一種十分珍貴的食用菌，含有豐富的蛋白質、多糖、維生素和酶等，味道鮮美，具有提高免疫力、抗輻射、養血壯體、護膚美顏、防癌抗癌及延緩衰老等多種保健功效[5-7]。但由于生長環境特殊和相關技術限制，正紅菇仍處于野生繁殖狀態，未見大規模人工培育的報道。廣西欽州市靈山縣高李村位于浦北西側，盛產正紅菇，林地以紅椎、馬尾松、桉樹和荔枝等樹木為主。正紅菇發生于紅椎林，而相同區域的馬尾松林、桉樹林和荔枝園卻無法長出正紅菇，其根本原因尚不可知。因此，分析正紅菇生長繁殖與其著生林地土壤環境特征之間的關系，對人工栽培正紅菇或人為措施提高正紅菇產量具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】廣西紅椎林生長的紅菇屬真菌主要有葡酒紅菇(Russulavinosa)、鱗蓋紅菇(Russulalepida)、血紅菇(Russulasangninea)和薔薇色紅菇(Russularosacea)[1，8]。韋仕巖等[8]調查發現，紅椎林內植被組成較簡單，主要分為喬木層、灌木層、草本層和地被物層，其中地被物層分布范圍較窄，僅在坡間的小溪兩側出現一些地衣和苔癬植物；正紅菇僅發生于紅椎林間，椎樹以外的植被只發揮生態調節作用。曾廣宇等[9]研究顯示，有機質含量豐富、質地疏松、透氣保濕性好、pH 4.5左右、肥力中等的土壤有利于正紅菇菌根的形成與發展，土壤肥力低的紅椎林地塊出產的正紅菇菇柄細而長，菌蓋薄且小，菌的等級與價格偏低，而施用有機肥可有效提高正紅菇的產量和品質。近年來，雖然人們對菌根菌與植物的共生生物學特性研究取得了長足的進展，但許多認知仍停留在表面現象上，缺乏將菌根菌與宿主植物作為一個整體的相關研究，對菌根菌子實體形成的生理生化知識匱乏，導致人工條件下孢子不易萌發，菌絲體培養困難，難以形成子實體，而且大多數外生菌根菌難以用人工栽培方法建立與宿主之間的共生關系，導致至今仍無法進行人工栽培[10-11]。已有研究發現，植物根圈促生微生物不僅能提高外生菌根菌對植物根部的侵染效率[12]，還能與外生菌根菌互作，從而改善土壤肥力并促進植物對養分的吸收[13]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，針對紅椎林土壤優勢微生物類群及相應肥力狀況及正紅菇生長繁殖與其著生林地土壤環境特征關系的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】基于傳統實驗方法和現代高通量測序技術，分析紅椎林土壤的生物學性狀及真菌多樣性特征，揭示正紅菇著生環境的土壤肥力和真菌優勢菌群等特征，為正紅菇的人工栽培及人為提高正紅菇產量和品質提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

采樣地位于廣西欽州市靈山縣高李村(東經109°16′31″，北緯22°12′30″)，地形以丘陵為主，屬亞熱帶季風氣候，雨量充沛，陽光充足，年均氣溫21.7 ℃，年無霜期平均348 d，年均降水量1658 mm，且多集中在夏季。

1.2 試驗材料

試驗材料于2018年10月在靈山縣高李村采集。分別采集紅椎林土壤(A區域)、馬尾松林土壤(B區域)、桉樹林土壤(C區域)和荔枝園土壤(D區域)。取樣時去除土壤表層雜質，采集各樹種根系附近3 cm的土壤。采用隨機取樣法，每個樹種選3棵樹，每棵樹取1個土壤樣本，裝入無菌封口袋并標記。樣品帶回實驗室后，分為2部分，一部分置于室內自然風干，用于理化性狀分析；另一部分過10目篩網，分別用于生物學性狀和土壤真菌多樣性分析。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤可培養微生物數量測定 土壤可培養微生物數量采用稀釋平板法[14]測定，其中，細菌使用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基培養，真菌采用馬丁氏瓊脂培養基培養，放線菌采用改良高氏1號培養基培養。

1.3.2 土壤C、N、P循環相關酶活性測定β-葡糖苷酶(β-Glucosidase)采用Hayano[15]的方法測定，磷酸酶(Phosphodiesterase)采用Tabatabai[16]的方法測定，氨肽酶(Aminopeptidase)采用Ladd[17]的方法測定。

1.3.3 土壤微生物生物量測定 土壤微生物生物量C采用氯仿熏蒸提取法測定，土壤微生物生物量P采用氯仿熏蒸提取—磷鉬藍比色法測定，土壤微生物生物量N采用氯仿熏蒸提取——茚三酮比色法[18]測定。

表1 測序類型及引物序列Table 1 The sequence type and primer sequence

1.3.4 土壤真菌多樣性分析 土壤真菌多樣性分析由上海美吉生物醫藥科技有限公司使用Miseq[19]平臺進行高通量測序，測序類型與引物序列見表1。

測序流程：首先通過基因組DNA抽提后，1.0 %瓊脂糖凝膠電泳基因組DNA。利用ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)引物對特定片段進行PCR擴增：95 ℃預變性3 min；進行27個循環(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s)；72 ℃后延伸10 min；最終保溫10 ℃直至擴增結束。凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產物，Tris-HCl緩沖液洗脫，2.0 %瓊脂糖電泳檢測，氫氧化鈉變性，產生單鏈DNA片段。

1.3.5 構建物種群落柱形圖和土壤物種組成Venn圖 利用上海美吉生物醫藥科技有限公司提供的數據分析平臺I-Sanger進行多樣性在線分析并構建物種群落柱形圖和土壤物種組成Venn圖，分析土壤真菌門水平和屬水平的群落多樣性，探究不同區域土壤真菌群落的結構與優勢菌群特征。

1.4 統計分析

試驗數據采用Excel 2013和SPSS 21.0進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 紅椎林土壤的生物學性狀特征

2.1.1 紅椎林土壤的可培養微生物數量 由表2可知，A區域土壤的可培養細菌和放線菌數量均顯著高于B、C和D區域土壤(P<0.05，下同)，可培養真菌數量也以A區域最高，但與B、C和D區域土壤差異不顯著(P>0.05，下同)。此外，B區域的可培養細菌數量顯著高于C和D區域，可培養放線菌數量高于C和D區域，但差異不顯著。說明紅椎林土壤的可培養細菌與放線菌數量明顯高于馬尾松林、桉樹林和荔枝園，而可培養真菌數量無顯著差異。

在那一刻，她感受到內心一塊沉靜的凹陷。她從未見過故鄉春梅。此刻她知道，它從未遠離。它是她身體內部的骨骼和血肉。它不會消失，她的存在就是它在世間存活的憑據并且將繼續延續。

2.1.2 紅椎林的土壤酶活性 由表3可知，A區域土壤的β-葡糖苷酶活性顯著高于B、C和D區域，B、C和D區域土壤的β-葡糖苷酶活性以D區域最高且顯著高于B和C區域；土壤磷酸酶活性以C區域最高，A區域次之，D區域最低，但4個區域間無顯著差異；土壤氨肽酶活性以C區域最高，顯著高于其他區域，而A區域土壤的氨肽酶活性最低，且顯著低于其余區域。說明紅椎林土壤較馬尾松林、桉樹林和荔枝園土壤具有更高的β-葡糖苷酶活性，更低的氨肽酶活性。

表2 不同林(園)區土壤的可培養細菌、真菌和放線菌數量Table 2 The amount of cultivable bacteria，fungi and actinomycetes in different forest soils

注：同列數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。
Note:Different lowercase letters in the same column represented significant difference. The same as below.

表3 不同林(園)區的土壤酶活性Table 3 Soil enzyme activities in different forest soils

表4 不同樹種根際土壤的微生物生物量C、N和P含量Table 4 Soil microbial biomass C，N and P content in rhizosphere soil of different forests (mg/kg)

2.1.3 紅椎林的土壤微生物生物量C、N、P含量 由表4可知，土壤微生物生物量C含量以D區域最高，顯著高于其他3個區域，C區域的土壤微生物生物量C含量最低，A區域次之，但A、B和C區域間無顯著差異；土壤微生物生物量N含量以B區域最高，顯著高于A、C和D區域，A區域的土壤微生物生物量N含量次之，但與C和D區域無顯著差異；土壤微生物生物量P含量以D區域最高，顯著高于A、B和C區域，C區域的土壤微生物生物量P含量最低，A區域次之，但A、B和C區域間無顯著差異。說明在4種林(園)中，紅椎林的土壤微生物生物量C、N、P含量總體上均處于中等偏低水平。

2.2 紅椎林的土壤真菌多樣性特征

2.2.1 土壤真菌的Alpha多樣性分析 稀疏曲線可反映樣品群落的多樣性，即檢驗測序深度可反映其所包含的微生物多樣性。從圖1可看出，當測序數據量達50 000時，各樣品的稀疏曲線趨于平緩，說明測序數據量合理，完全可反映樣品中真菌菌群的多樣性信息，而繼續測定更多的數據量僅會產生少量新的OTU(Operational taxonomic units，一種分類水平，按序列之間的相似性進行聚類而形成的分類單元)。

Alpha多樣性指數能反映群落的豐富度和多樣性特征，Shannon指數與Simpson指數是衡量微生物多樣性的指數之一。由表5可知，不同林(園)區土壤的真菌多樣性Shannon指數、豐富度Ace指數和Chao指數均以D區域最高，且顯著高于A、B和C區域，而Simpson指數以A區域最高，且顯著高于B、C和D區域；各區域土壤真菌的多樣性Shannon指數排序為D區域>C區域>B區域>A區域，與Simpson指數排序相反。說明紅椎林的土壤真菌多樣性較低，與其他3種人工林相比結構相對單一。

圖1 不同林(園)區土壤真菌OTU數量的稀疏曲線Fig.1 Rarefraction curve of OTU with fungi indifferent forest soils

2.2.2 土壤真菌優勢群落分析 基于門分類水平發現，所測樣品由5個優勢真菌門組成，分別為Basidiomycota(擔子菌門)、Ascomycota(子囊菌門)、Zygomycota(接合菌門)、Rozellomycota和未分類的真菌菌門(圖2)。其中，A區域中優勢真菌類群占比大于1.0 %的優勢菌門主要由擔子菌門、子囊菌門和接合菌門組成，以擔子菌門所占比例最大，為92.25 %，其次為子囊菌門和接合菌門；而B區域的真菌優勢菌群組成與A區域存在差異，占比組成大于1.0 %的優勢真菌門除擔子菌門和子囊菌門真菌與A區相同外，未分類的真菌菌門占比達18.53 %；C區域真菌優勢菌群占比組成大于1.0 %的優勢菌門由擔子菌門、子囊菌門、接合菌門和未分類的真菌菌門組成；D區域真菌優勢菌群占比組成大于1.0 %的優勢菌門最多，分別由擔子菌門、子囊菌門、接合菌門、Rozellomycota和未分類的真菌門組成(表6)。說明紅椎林土壤中擔子菌門真菌具有高占比，是主要優勢菌門，而其余3個區域土壤呈現更多樣的優勢菌門。

表5 不同林(園)區的土壤真菌Alpha多樣性指數Table 5 Alpha diversity index of fungi in different forest soils

表6 不同林(園)土壤中真菌門分類水平優勢菌群組成占比Table 6 Percent of dominant community on phylum level of fungi in different forest soils (%)

圖2 不同林(園)區土壤真菌門分類水平的群落相對分布Fig.2 Relative distribution of community on phylum level of fungi in different forest soils

2.2.3 土壤真菌群落分析結果 物種Venn圖主要用于統計多個樣本中所共有和獨有的OTU數目，可直觀地表現不同林(園)區土壤真菌屬分類水平組成的相似性及重疊情況。結果(圖4)發現，在屬分類水平上，A區域含有真菌屬145個，B區域含有真菌屬118個，C區域含有真菌屬220個，D區域含有真菌屬276個，4種不同林(園)區土壤中有67個共有的真菌屬，占全部真菌屬的8.83 %；A區域有11個特有真菌屬，占A區域總真菌屬的7.59 %；B區域有8個特有真菌屬，占該區域總真菌屬的6.78 %；C區域有38個特有真菌屬，占該區域總真菌屬的17.27 %；D區域有100個特有真菌屬，占該區域總真菌屬的36.23 %。說明紅椎林土壤的特有真菌數量在真菌屬水平相對較少，與馬尾松林、桉樹林和荔枝園土壤真菌的相似性較大。

圖3 不同林(園)區土壤真菌屬分類水平的群落相對分布Fig.3 Relative distribution of community on genus level of fungi in different forests soils

表7 不同林(園)土壤中真菌屬分類水平優勢真菌屬的組成占比Table 7 Percent of dominant community on genus level of fungi in different forest soils (%)

3 討 論

細菌占整個土壤微生物群落的70 %～90 %，在維護土壤健康、拮抗土傳病害及養分循環等方面發揮重要作用[20]。真菌在土壤微生物群落中所占比例僅次于細菌，可分解糖類、淀粉、纖維素、木質素和單寧等多種有機物，并參與腐殖質的形成和分解、進行氨化作用和硝化作用，尤其在酸性森林土壤有機質的轉化中起重要作用[21]。本研究中，紅椎林土壤中的可培養細菌、放線菌數量均顯著高于其他3種林(園)區土壤，但可培養真菌數量與其他3種林(園)區土壤無顯著差異，可能與紅椎林中正紅菇的出菇和生長需要更苛刻的環境條件有關，如專一的根系分泌物、空氣、土壤溫度、水分及適宜的土壤pH和碳氮比等，而微生物數量多的環境可能更有利于形成和維護正紅菇出菇及生長所需的環境條件。

圖4 不同林(園)區土壤真菌屬分類水平的Venn圖Fig.4 Diagram of Venn on genus level of fungi in different forest soils

土壤酶參與土壤中幾乎所有有機物質和營養元素的循環[22]，其活性不僅能指示土壤生態系統功能變化的多樣性和穩定性[23]，亦是評價土壤健康和肥力水平的重要指標[24]。本研究中，紅椎林土壤中除磷酸酶活性與其他林(園)區土壤無顯著差異外，β-葡糖苷酶活性顯著高于其他3種林(園)區土壤，氨肽酶活性顯著低于其他3種林(園)區土壤，表明與其他林(園)區土壤相比，紅椎林土壤具有特異的碳、氮循環相關酶活性。該現象可能與正紅菇的繁殖和生長均需適宜基質(土壤)碳氮比緊密相關，即自然界可能以自我調節的方式調控土壤中涉及碳、氮循環相關酶的活性以實現正紅菇繁殖與生長所需的碳氮比。土壤微生物生物量C、N、P含量亦是衡量土壤質量、指示土壤肥力和作物生產力的一個重要指標[25]。紅椎林土壤中的微生物生物量C、N、P含量在4種林(園)區土壤中處于相對較低的水平，不僅低于人為干擾頻繁的荔枝園土壤，還低于以用材林為用途的馬尾松林和桉樹林，可能與對正紅菇的生境特性缺乏科學認知，目前仍無科學管理良策，導致僅有天然產出而鮮有人為投入，從而出現指示紅椎林土壤肥力狀況的微生物生物量偏低的現象有關。

Shannon指數是用于衡量物種多樣性的指數，Simpson指數表示在群落中隨機抽樣的個體屬于同一物種的概率，也用來衡量物種多樣性，Ace指數和Chao指數是衡量物種豐富程度的指數，數值的大小表示物種豐富度的高低。Ace和Chao指數越大，說明物種的豐富度越高；而Shannon 指數越大，Simpson指數越小，說明樣品的物種多樣性越高[26-28]。本研究基于高通量測序技術分析發現，4種林(園)區土壤中的真菌Alpha多樣性以人為干擾最頻繁的荔枝園土壤最高，可能與荔枝園在實際生產中進行更頻繁的施肥緊密相關；紅椎林土壤中的真菌Alpha多樣性在另3種林區土壤中呈現低值，可能與其更為單一的優勢真菌門屬組成緊密相關。基于門分類水平發現，紅椎林土壤中的優勢真菌門雖然與其他3種林(園)區土壤相仿，主要由擔子菌門、子囊菌門、接合菌門、Rozellomycota和未確定的門類組成，但不同門類真菌的占比差異明顯。其中，擔子菌門是紅椎林土壤的主要優勢真菌門類，組成占比達92.26 %，已有研究發現，大多數土壤真菌屬于擔子菌門或子囊菌門[29]，但在用材林(馬尾松林和桉樹林)及荔枝園土壤中，擔子菌門真菌的占比明顯降低，呈現擁有更為多樣的優勢真菌門類。在屬分類水平上，4種不同林(園)區土壤中雖然擁有相似的優勢真菌屬組成，但紅椎林土壤中優勢真菌屬組成更簡單，紅菇屬是紅椎林土壤中的優勢真菌屬，占比達78.37 %；與之相比，馬尾松林土壤中紅菇屬真菌的占比僅有7.58 %，而桉樹林和荔枝園土壤中紅菇屬真菌占比為零。說明4種林(園)雖然具有相同的環境條件，但紅椎林中能產出正紅菇，而馬尾松林、桉樹林和荔枝園卻無法長出正紅菇的根本原因，應為紅菇屬真菌的繁殖與生長需要專一的共生體與特定環境。

4 結 論

不同林(園)土壤肥力狀況不是正紅菇長出與否的決定性因素；紅椎林土壤中的擔子菌門紅菇屬真菌數量顯著高于馬尾松林土壤，而桉樹林和荔枝園土壤中紅菇屬真菌占比為零，即紅椎林土壤具有富集擔子菌門紅菇屬真菌的功能，且紅菇屬真菌的繁殖與生長需要專一的共生體與特定環境，是紅椎林出產正紅菇的根本原因。