基于FOXO信號通路探討益腎喘寧湯對腎氣虛哮喘的作用機制*

姜春燕 宋 紅 孔麗婭 鄭小偉

浙江中醫藥大學基礎醫學院 浙江 杭州 310053

支氣管哮喘以炎性細胞浸潤、氣道高反應性以及氣道重塑[1]為主要特征，由于該疾病患病率、復發率和經濟影響日益增加，已成為全球關注的一個原因。全球疾病負擔研究估計全球有3.39億哮喘患者[2]。目前，哮喘的發病機理仍未全部闡明。從免疫學角度分析，哮喘是由各種介導和相互作用的免疫細胞及相應細胞因子引起[3]。相關研究表明，Th1/Th2免疫失衡、Treg/Th17免疫失衡在哮喘的發病進程中發揮重要作用[4-5]。本研究在卵清蛋白致敏法與多因素復合法結合建立腎氣虛哮喘模型基礎上，通過磷酸化抗體芯片技術，篩選出腎氣虛哮喘發病機制FOXO信號通路的相關蛋白，探討益腎喘寧湯可能的作用靶點，為臨床提供可靠的動物實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：SPF級雄性Wistar大鼠32只，鼠齡6～8周，重量220～250g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，在浙江中醫藥大學動物實驗中心按《中華人民共和國實驗動物管理條例》進行喂養。

1.2 主要試劑與藥物：OVA卵清蛋白（OVA，gradeV，sigma有限公司，批號：SLBQ9036V）；Al(OH)3粉末（上海凌峰化學試劑有限公司，批號：20130818）；3%戊巴比妥鈉（浙江中醫藥大學動物實驗研究中心）；大鼠血清睪酮（T）、甲狀腺素（T4）ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所）；大鼠血清皮質醇（COR）ELISA試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司）；益腎喘寧湯由熟地黃、懷山藥、山茱萸、澤瀉、丹皮、茯苓、苦參、天漿殼各12g，旋覆花、黛蛤散、生黃芪各15g，北五味子5g，沉香8g組成，中藥飲片均從浙江中醫藥大學中醫門診部購買，用自動煎藥機制備成含生藥量1.6g/ml的藥液，存放于4℃冰箱保存，備用；普米克令舒（布地奈德懸浮液）（浙江大學附屬第二醫院，批號：LOT 322335）。

1.3 主要儀器：超聲霧化吸入器（江蘇魚躍醫療設備股份有限公司）；離心機（Pico21，Thermo Scientific，USA）；酶標儀（PE Victor，PE，USA）；芯片小型離心機（ChipMate PMC-082，Tomy，Japan）；芯片掃描儀（GenePix 4000B，Axon Instruments，USA）；軟件 GenePix Pro 6.0（Axon Instruments，USA）。

1.4 方法：適應性飼養1周后，將實驗大鼠隨機分為正常組、腎氣虛哮喘組、中藥組和中西藥組，8只/組。參照課題組前期實驗方案[6]，除正常對照組，其余各組大鼠均采用OVA致敏法進行哮喘造模，游泳力竭法、恐傷腎雙因素復合法進行腎氣虛證造模，連續造模14天。實驗第15天開始，中藥組、中西藥組大鼠均予益腎喘寧湯灌胃，中西藥組大鼠另予普米克令舒霧化吸入，日給藥劑量參照《醫學實驗動物學》計算大鼠的等效劑量進行計算。實驗第29天，將大鼠麻醉后腹腔采血，解剖后分離肺臟并取出，用生理鹽水沖洗，切取直徑為4～5mm大小的肺組織置于凍存管內，迅速投入液氮瓶中，當全部樣本收集完后再轉移至－80℃冰箱保存；另切取部分肺組織放入10%中性福爾馬林溶液中，待測。

1.5 模型驗證：觀察各組大鼠實驗前后一般情況的改變，包括飲食情況、活動量、呼吸狀態、毛發光澤度等；顯微鏡下觀察、分析肺組織常規HE染色、病理切片結果；ELISA檢測各組大鼠腎氣虛證的相關指標即血清T、T4、COR水平。

1.6 磷酸化抗體芯片技術：分述如下。

1.6.1 樣品蛋白抽提：各組隨機抽取一個樣本，4℃預冷用1×磷酸緩沖溶液（PBS）（pH=7.4）反復清洗至上清無明顯血色，加入200μl芯片專用裂解液，勻漿3次，加入Full Moon提供的細胞裂解磁珠，渦旋5次。離心后取上清移至新離心管中，重復操作至上清澄清為度。

1.6.2 裂解液/標記緩沖液置換：取出柱子離心，加入650μl標記緩沖液，渦旋，除去底部的氣泡，室溫平衡60min，放入樣本收集管，離心。移至新的收集管中，加入100μl的蛋白質提取物，離心。

1.6.3 樣品蛋白標記：使用前離心Biotin Reagent，加入二甲基甲酰胺（DMF）配制成濃度為10μg/μl，標記為Biotin/DMF。取蛋白樣品50μg到離心管中，加入標記緩沖液稀釋至總體積為75μl。每管加入3μl Biotin/DMF，混勻，加入35μl終止液。

1.6.4 芯片封閉：將芯片從4℃冰箱取出，室溫平衡45min，放入培養皿中，用封閉溶液完全浸沒芯片，將培養皿放到水平搖床上，封閉45min。用Milli-Q水重復洗滌芯片10次，甩干。

1.6.5 芯片雜交：將6ml雜交緩沖液移入15ml離心管中，加入0.18g脫脂奶粉配制成雜交液。取50μg生物素標記后的樣品加到雜交液中，標記為Protein Coupling Mix。芯片放入雜交盒中，緩慢加6ml Protein Coupling Mix于芯片表面，置于水平搖床反應。稀釋Wash Buffer洗液。將芯片移到裝有Wash Solution的培養皿中，置于水平搖床反應，重復清洗3次。用Milli-Q水重復洗滌芯片10次，甩干。

1.6.6 芯片掃描：使用Detection Buffer稀釋Cy3-Streptavidin，配制成0.1%的Cy3-Streptavidin Solution，加入到培養皿中，將芯片沒入其中，置于水平搖床反應20min。將芯片移到裝有30ml Wash Solution的培養皿中，置于水平搖床反應，重復清洗3次。使用Milli-Q水全面洗滌芯片重復10次。離心干燥芯片。GenePix 4000B掃描芯片。

1.7 數據處理：對獲得的芯片圖像，使用GenePixTMPro v6.0軟件讀取原始數據。對芯片背景、陽參及內參位點的信號強度情況進行統計。用SPSS 20.0統計軟件將數據進行統計分析，采用t檢驗來比較組間差異，視P＜0.05為差異具統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般情況觀察：整個造模過程中，正常組大鼠無明顯變化，皮毛順滑光澤，呼吸平穩，行動自如，飲食二便均正常；腎氣虛哮喘組大鼠造模后呼吸頻率加快、口唇發紫，在每日霧化激發及游泳后時尤為顯著，體重增長幅度減緩，毛發較正常組粗糙色黯，時有躁動不安、抓耳撓腮、二便失禁等表現；中藥組和中西藥組上述情況較腎氣虛哮喘組均有明顯改善。

2.2 肺組織HE染色結果：正常組樣本的肺泡、支氣管結構均清晰完好；腎氣虛哮喘組大鼠肺組織切片可觀察到以嗜酸性粒細胞、中性粒細胞為主的炎性細胞浸潤、支氣管上皮脫落和平滑肌增厚的情況；中藥組、中西藥組大鼠的肺組織切片可見上述病理改變均見減輕。

2.3 大鼠血清ELISA檢測結果：腎氣虛哮喘組大鼠血清的T、T4、COR含量均低于正常組（P＜0.05），中藥組和中西藥組指標較腎氣虛哮喘組均有所上升，結合對大鼠癥狀、體征的觀察，提示腎氣虛證造模成功。詳見表1。

表1 各組大鼠血清中T、T4、COR測定比較（±s，ng/ml，n=8）

表1 各組大鼠血清中T、T4、COR測定比較（±s，ng/ml，n=8）

注：與正常組比較，△P＜0.05；與腎氣虛哮喘組比較，#P＜0.05。

COR 18.70±2.20 16.24±1.46△18.64±1.71#17.83±1.28#組別正常組腎氣虛哮喘組中藥組中西藥組T 95.26±16.06 48.89±23.17△71.25±24.71#70.90±25.30#T4 32.85±9.41 21.32± 6.14△27.41±5.73#28.80±10.63#

2.4 芯片檢測結果：從各組大鼠中隨機抽取一個肺組織樣本，采用磷酸化抗體芯片技術檢測大鼠肺組織FOXO通路相關蛋白磷酸化水平變化。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織蛋白Raf1、FOXO1磷酸化水平

3 討論

哮喘是一種發病率較高的慢性氣道炎癥性疾患。近幾十年來，自身免疫性（Th1相關）和過敏性（Th2相關）疾病的患病率都有所上升[7]。課題組前期研究發現Th17/Th1、Th17/Treg和Treg/Th2的免疫失衡在腎氣虛哮喘發病中發揮著重要作用。

Raf1是MAPK通路上的重要蛋白，是Raf激酶家族的成員，調節許多基本的細胞過程，包括增殖、分化、凋亡、運動和代謝，并且可與許多蛋白質包括p21活化激酶（PAK3）、絲氨酸/蘇氨酸激酶3（STK3）和蛋白激酶C（PKC）的活性相互作用和調節[8]。Raf激酶是T細胞信號傳導中重要的細胞內介質，對炎癥細胞的增殖至關重要，在Th1細胞產生IFN-γ中起著重要作用[9]。

轉錄因子的叉頭盒蛋白O（FOXO）家族亞類由FOXO1、FOXO3、FOXO4和 FOXO6四個成員[10]。FOXO1是Raf1的下游因子，參與了T細胞的穩態和存活，通過物理抑制轉錄因子rorγt活性（Th17細胞的主要調節因子）來負性調節Th17細胞的分化和致病性。此外，FOXO1還參與調節性CD4+T細胞（Tregs）的發育和功能[11]。多項研究表明FOXO1在炎癥信號中的促炎作用[12-13]。FOXO1在過敏性哮喘炎癥小鼠模型中，集中參與過敏性哮喘肺部炎癥的發生，FOXO1過度表達小鼠表現為過敏性氣道炎癥，并加重了Th2免疫反應，這些反應與趨化因子的產生和黏液細胞增生有關，對FOXO1進行藥理學抑制能顯著減輕哮喘肺部炎癥的發展[14]。

益腎喘寧湯是以六味地黃丸為基礎，又加黃芪益氣，五味子斂氣，沉香納氣，旋覆花降氣，苦參、天漿殼、黛蛤散化痰清肺、止咳平喘，全方補中有瀉，升中有降，肺腎同調，相得益彰。本實驗利用磷酸化抗體芯片技術對腎氣虛哮喘肺組織中差異表達蛋白進行篩選，獲得2個主要的差異蛋白。有研究表明[15]，蛋白質磷酸化在細胞信號轉導、細胞分化、基因表達、DNA復制中扮演著重要的角色。因此，磷酸化抗體芯片技術是研究疾病發病機制、藥物效應和生物學功能的重要手段。本實驗中，與正常組相比，腎氣虛哮喘組肺組織中Raf1、FOXO1磷酸化水平顯著上調，提示Raf1、FOXO1可能參與了腎氣虛哮喘的發病進程；與腎氣虛哮喘組比較，益腎喘寧湯干預之后大鼠肺組織內Raf1、FOXO1磷酸化水平有明顯的下調，提示該方可能通過下調腎氣虛證哮喘大鼠肺組織FOXO信號通路的Raf1、FOXO1磷酸化水平，從而糾正T細胞分化時Th1、Th2、Th17和Treg間的免疫失衡，以緩解氣道慢性炎癥。關于益腎喘寧湯干預腎氣虛證哮喘的作用機制仍需進一步研究。