益氣溫陽方對變應性鼻炎小鼠NK細胞細胞因子分化影響的研究

嚴芮雯,陳旭青,嚴道南

(1.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210000；2.南京中醫藥大學附屬第一醫院,江蘇省中醫院，江蘇 南京 210000)

過敏性鼻炎是常見的發生在鼻部的非感染性炎性疾病(Ⅰ型變態反應),臨床癥狀嚴重影響了人們的生活、工作、學習，尤其影響了兒童的生長發育。NK細胞是人體非特異性免疫系統的組成部分，是機體抗病毒、抗感染以及機體免疫調節中不容忽視的效應細胞。實驗研究發現，類似于T細胞，NK細胞在不同的條件下亦分化為NK1/NK2型細胞亞群。臨床研究表明，益氣溫陽方治療變應性鼻炎肺脾虛寒證有很好的療效，能很好的緩解變應性鼻炎臨床癥狀[1]。本研究主要通過研究益氣溫陽方對NK細胞刺激活化后的亞群NK1型細胞、NK2型細胞細胞因子IL-5、IL-10、IL-4、INF-γ的影響，來分析益氣溫陽方對NK細胞分化的影響，初步探討益氣溫陽方對變應性鼻炎患者機體免疫細胞NK細胞的影響機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

SPF級C57BL/6小鼠30只，體質量25～30 g，由南京中醫藥大學動物中心提供，按5只/籠飼養于SPF級別飼養環境，自由進食飲水。

1.1.2 主要儀器

酶標儀(美國BioTekInstruments公司)；CO2培養箱(美國Thermo Fisher公司)；37 ℃恒溫箱(北京福意聯醫療設備有限公司)；小型臺式高速離心機(德國 Sigma公司)。

1.1.3 試劑

IL-5 Mouse ELISAKit(美國 eBioscience)；IL-5 Mouse ELISA Kit(美國 eBioscience)；RPMI 1640培養液(美國 Gbico公司)；OVA(美國Sigma公司)。

1.1.4 藥物

益氣溫陽方組成：黨參10 g，黃芪15 g，干姜9 g，桂枝10 g，麻黃6 g，五味子10 g，地龍10 g，烏梅10 g和甘草3 g。加水常規煎煮，濾液分別濃縮至1.4 g/mL、0.7 g/mL、0.35 g/mL，4 ℃保存。

鹽酸左西替利嗪片由重慶華邦制藥有限公司生產，5 mg×15片。

刺激劑：高爾基體+粉塵螨代謝培養基提取液，過濾除菌，-20 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 分組及模型準備

30只C57BL/6小鼠隨機分為空白組、模型組、益氣溫陽方低劑量組、益氣溫陽方中劑量組、益氣溫陽方高劑量組和西替利嗪組共6組。除空白組外，在第0天、第7天，第14天以40 μg的OVA作抗原，2 mg氫氧化鋁作免疫佐劑，加0.9% NaCl溶液定容至400 μL，腹腔注射小鼠進行致敏，空白組以等量生理鹽水代替；從第21天開始，用10%的OVA 溶液滴入小鼠鼻腔，每側各20 μL進行激發，每天激發1次，持續7 d，空白組以等量生理鹽水代替。

1.2.2 藥物干預

自造模第21天～第27天，對小鼠進行灌胃，益氣溫陽方低劑量組、中劑量組、高劑量組以及西替利嗪組分別按0.07 g/(10 g·d)、0.14 g/(10 g·d)、0.28 g/(10 g·d)、16.67 μg/(10 g·d)給藥，各組均按0.2 mL/(10 g·d)液體量灌胃，模型組和空白組以等量生理鹽水灌胃。

1.2.3 取含藥血清

灌胃7 d后采用腹主動脈真空采血管取血，室溫靜置1 h，2 500 r/min，4 ℃離心20 min，分離血清，56 ℃水浴滅活30 min，過濾除菌，-20 ℃保存。

1.2.4 原代NK細胞的分離純化

取正常小鼠，處死后分離脾臟，移至操作顯微鏡下，剝離血管膜，剪碎組織；以0.125%胰酶混懸后放入CO2培養箱中消化20 min，5 min搖晃一次；加入1 mL血清終止消化，靜置2 min后移去上清；加入2 mL全培緩慢、連續吹打10次，靜置后吸取上清，反復3次，取得單細胞混懸液；參照NK Cell Isolation KitⅡ試劑盒，以磁性納米微球結合NK細胞特異性抗原，將結合后的細胞混懸液經過特定磁場吸附NK細胞，分離得到NK細胞混懸液。

1.2.5 體外刺激NK細胞

10%含藥或空白血清RPMI 1640完全培養基制備3.75×105個/mL NK細胞混懸液，移500 μL細胞混懸液于24孔內，除空白組外，每組加入高基體阻斷劑+佛波酯+離子霉素或高基體阻斷劑+塵螨試劑； CO2培養箱孵育24 h。

1.2.6 ELISA檢測細胞因子IL-5、IL-10、IL-4、INF-γ

回收上清，采用Elisa技術，參照試劑盒說明書，分別檢測IL-5、IL-10、IL-4、INF-γ的樣本含量。

1.2.7 統計學方法

2 結果

2.1 干預及造模期間動物一般狀態

灌胃第3天，部分西替利嗪組及益氣溫陽方高劑量組小鼠大便稀，灌胃第5天，1只益氣溫陽方中劑量組小鼠由于灌胃針刺較深，小鼠抽搐死亡。余小鼠在干預及造模期間無特殊情況，毛色、攝食量、行為、大小便等一般狀態基本正常。

2.2 NK細胞混懸液流式純度檢測

本次實驗研究對象為CD3-、CD16+、CD56+NK細胞，提取的NK細胞流式純度檢測結果如圖1示，CD3目標抗原沒有表達(染色陰性)，CD56和CD16兩種目標抗原都有表達(雙陽性)。

圖1 NK細胞混懸液流式純度檢測

2.3 細胞因子檢測結果

益氣溫陽方能抑制NK2型細胞細胞因子IL-4、IL-5分泌(P<0.05)，其中益氣溫陽方中劑量組抑制NK2型細胞細胞因子IL-4、IL-5分泌作用最明顯(P<0.05)，與西替利嗪組差異無統計學意義(P>0.05)。益氣溫陽方對能促進NK1型細胞細胞因子IL-10分泌(P<0.05)，其中益氣溫陽方中劑量組對促進NK1型細胞細胞因子IL-10分泌作用最明顯(P<0.05)，但益氣溫陽方對NK1型細胞因子INF-γ分泌無促進作用(P<0.05)。西替利嗪組能抑制NK2型細胞細胞因子IL-4、IL-5分泌(P<0.05)，抑制作用高于益氣溫陽方低、高劑量組(P<0.05)，與益氣溫陽方中劑量組差異無統計學意義(P>0.05)；西替利嗪組能促進NK1型細胞細胞因子IL-10分泌(P<0.05)，效果均高于益氣溫陽方組(P<0.05)；但西替利嗪組對NK1型細胞因子INF-γ分泌無促進作用(P>0.05)。結果見表1。

表1 各組細胞因子水平比較

注：與模型組比較，*P<0.05;與空白組比較，△P<0.05。

3 討論

NK細胞是能夠分泌免疫細胞因子的效應淋巴細胞，具有固有免疫和適應性免疫雙重特性。大量實驗證明變應性鼻炎主要是由IgE介導的，多種免疫細胞、免疫調節因子參與的細胞免疫系統紊亂的鼻黏膜變態反應，而NK細胞作為免疫淋巴細胞，是維持免疫環境的穩定以及機體正常免疫功能的重要一員。因此當過敏反應發生時，免疫功能失常，刺激NK細胞活化，誘導NK細胞分化成NK1和NK2型細胞，分泌出一系列促炎反應類以及免疫抑制類細胞因子，變應性鼻炎患者表現為明顯的NK2型偏倚。

NK細胞通常是CD3-、CD56+、CD16+，TCR-，BCR-的淋巴樣細胞，CD56+NK細胞亞群主要參與細胞因子的分泌，本實驗提取培養的主要為CD56+NK細胞亞群。在臨床研究中，Peritt等[2]發現在一定條件下培育CD16+或CD56+NK細胞，能誘導出分泌INF-γ的NK1型亞群和分泌IL-5和IL-13的NK2型亞群。Katsumoto等[3]認為IL-2和IL-12能誘導NK1型細胞分泌INF-γ、IL-10，NK2型亞群產生IL-5和IL-13，NK2型偏倚的原因主要是由于INF-γ減少，而Wei等(4)認為NK2型偏倚的原因主要是IL-4的增多。本次實驗研究發現，變應性鼻炎小鼠NK細胞細胞因子INF-γ、IL-4分泌增多明顯，表明變應性鼻炎小鼠NK2型偏倚可能主要是由于IL-4的增多。

變應性鼻炎被稱為“鼻鼽”，中醫學認為鼻鼽主要是由于肺氣虛寒，肺衛不固，外邪趁虛而入，鼻為肺之外竅，外邪侵犯，首當其沖，肺氣失宣，鼻竅氣機不暢，津液停聚，以致患者發生鼻塞、鼻癢、流清涕等臨床癥狀。現代研究表明，中醫治療變應性鼻炎主要是通過運用抗過敏作用的中藥以及通過調節臟腑氣血陰陽運行平衡，改善機體內環境來提高機體抵抗外界過敏原的免疫功能。益氣溫陽方中麻黃宣肺平喘利水，桂枝解表散寒、溫肺化飲，二者相伍增強通陽宣散解表之力，大量藥理學研究表明，兩者都具有很好抗炎抗過敏的作用[5-6]；干姜味辛，大熱，溫中散寒、溫肺化飲；五味子、烏梅味酸，都具有斂肺止咳之效，現代藥理學表明，五味子和烏梅[7-8]都具有免疫調節作用，可以提高機體的免疫力；黃芪益氣固表、補養氣血，對機體體液免疫和細胞免疫都有很好的促進作用[9]；黨參健脾益氣、補氣養血，對機體的免疫系統有很強的增強作用[10]；辛夷祛風散寒、通鼻竅，具有抗過敏的功效，是治療過敏性鼻炎的要藥；地龍性寒，清熱平喘，現代藥理學研究發現，地龍具有抗組胺、提高免疫的作用[11]。本次實驗通過研究益氣溫陽方引起活化后的NK1型細胞細胞因子IL-10、INF-γ以及NK2型細胞細胞因子IL-4、IL-5分泌的改變，說明本方可以抑制NK2型細胞細胞因子的釋放，促進NK1型細胞因子的表達，提示益氣溫陽方治療變應性鼻炎的機制可能與其抑制NK2型細胞活化，促進NK1型細胞活化有關。

西替利嗪是公認治療AR比較有效的抗過敏藥，因此本實驗設置西替利嗪為陽性對照組，對比中醫藥的治療效果。雖然臨床上西替利嗪治療AR效果很好，但是缺少關于西替利嗪對NK細胞調節機制的相關研究報道，本實驗研究結果表明西替利嗪對活化后的NK1型細胞細胞因子IL-10有促進作用，并抑制NK2型細胞細胞因子IL-4、IL-5分泌，這為西替利嗪調控NK細胞治療AR患者機制方面做出可能的補充，可以為后續西替利嗪對NK細胞的藥理作用研究提供一些參考。

本次實驗表明，益氣溫陽方低、中、高劑量均不同程度的抑制了活化后的NK2細胞釋放IL-4、IL-5，以及促進活化后的NK細胞釋放IL-10，其中益氣溫陽方中劑量效果最好，最大程度抑制了IL-4、IL-5的釋放以及促進了IL-10的釋放。綜合上述指標可以看出，益氣溫陽方能通過影響活化后的NK細胞促炎以及免疫抑制類細胞因子的分泌和合成，有效干預變應性鼻炎的發病機制，發揮益氣溫陽方治療變應性鼻炎的作用。

本次實驗將中醫藥調節機體內環境平衡與調節活化后的NK細胞細胞因子的分泌和成相結合，探索治療變應性鼻炎的新思路，是本實驗的創新點，但還存在一些問題，如本實驗研究的細胞因子較少，應該對活化后的NK細胞釋放的細胞因子進行更多的研究，體外實驗仍需進一步完善。隨著現代科學技術的發展，筆者相信從現代科學角度闡釋、理解中醫宏觀的哲學理念將會取得很大的進展，中醫藥在治療變應性鼻炎疾病方面會有更大的進步。