三七與黃連配伍時三七中3個有效成分溶出率變化規律研究

賈明璐，王靜，田會東，陳雪平，王瑞*

(1.漯河市中心醫院，河南 漯河 462000;2.漯河醫學高等專科學校，河南 漯河 462000)

在臨床上，將兩味藥一起應用往往能起到良好的協調或制約作用，這種在臨床最習用的兩味藥就是藥對，也稱“對藥”[1]。藥對不是兩味藥的簡單疊加，而是歷代醫藥學家用藥經驗的科學提煉和智慧結晶，是中醫用藥的特色之一[2]。

三七是五加科植物三七的干燥根，常用于治療冠心病、糖尿病、心絞痛等[3]；黃連是毛茛科植物黃連的干燥根莖，具有抗氧化、降壓與降血糖的作用[4]。二者合用，具有清熱燥濕、益氣生津之功效，是治療“消渴”的典型代表藥對。研究表明，兩種藥材配伍后易產生相互作用，或產生助溶或產生沉淀，使有效成分溶出率發生變化，從而影響療效[5]。活性成分溶出率隨配伍比例變化規律是中藥復方一個重要的研究內容[6-7]。然而，三七-黃連的最佳配伍比例尚無相關報道。因此，本試驗設計了9個配伍比例(1∶0、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、0∶1)參照《中華人民共和國藥典》[8]質量要求，研究三七與黃連的配伍比例對三七中3個組分溶出率的影響，并從化學成分角度考察最佳配比，為三七-黃連藥對的進一步開發應用提供理論依據。

1 儀器與材料

島津LC-20A高效液相色譜儀(DGU-20A3R在線脫氣系統、全波長色譜工作站、SPD-M20A光電二極管陣列紫外可見光檢測器，日本島津公司)；SIL-20AC自動進樣器、CT0-20AC柱溫箱(日本島津公司)；16K臺式高速離心機(珠海黑馬醫學儀器有限公司)；SB25-12D超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；JY電子分析天平(上海衡平儀器儀表廠)；Milli-Q純水儀(美國Millipore公司)。

三七皂苷R1對照品(批號:110745-201820，純度93.1%，中國食品藥品檢定研究院)；人參皂苷Rb1對照品(批號:GSB-107939，純度98.34%，斯坦福分析化學公司)、人參皂苷Rg1對照品(批號：GSB-705891，純度99.87%,斯坦福分析化學公司)；三七和黃連均購自安徽瑞生源中藥飲片有限公司，經本醫院中藥房田正印主任鑒定為五加科植物三七[Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen]的干燥根及根莖和毛茛科植物黃連(CoptischinensisFranch)的干燥根莖。

乙腈(色譜純，Fisher)；甲醇(色譜純，科密歐)；乙醇(分析純，大茂)；水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm )；流動相為乙腈(B)-水(A)，線性梯度洗脫(0～25 min，2%→20% B；25～50 min，20%→45% B；50～60 min，45%→70% B；60～65 min，70%B；65～70 min，70%→2% B)；流速:1.0 mL/min；柱溫:35 ℃；檢測波長:203 nm；進樣量:20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液制備

精密稱取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1適量，甲醇溶解定容于25 mL容量瓶中，搖勻，制成含三七皂苷R10.362 mg/mL,人參皂苷Rg11.350 mg/mL、人參皂苷Rb11.400 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備

分別按表1稱取三七、黃連兩味藥材粗粉，置于500 mL圓底燒瓶中，加20倍量60%乙醇，加熱回流2 h，稱重，補足失重，搖勻，過濾，濾液置于離心管中，12 000 r/min離心10 min，取上清液，加水稀釋1倍，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得，避光低溫保存。

表1 各配伍比例藥材稱取量

2.3 HPLC檢測色譜圖

分別取上述溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，在“2.1”項色譜條件下測定，色譜圖見圖1。

2.4 線性考察

分別量取“2.2.1”項下混合對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，置于10 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻。精密吸取20 μL，注入高效液相色譜儀，在“2.1”項色譜條件下進樣測定分析。以濃度(mg/mL)為X坐標，峰面積為Y坐標繪制標準曲線，建立回歸方程。結果表明，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1在各自濃度范圍內均呈現良好的線性關系。如表2所示。

2.5 精密度試驗

取“2.2.1”項下的混合對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下連續進樣6次，結果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1峰面積的RSD分別為0.31%、0.57%、0.78%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取“2.2.2”項下三七與黃連之比為1:1供試品溶液，分別于0、4、8、12、24、48 h進樣，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1峰面積RSD值分別為1.93%、 1.05%、1.68%，表明供試品溶液在48 h內穩定。

注：1三七皂苷R1；2人參皂苷Rg1；3人參皂苷Rb1圖1 混合對照品(A)、黃連陰性對照品(B)、三七陰性對照品(C)、樣品(D)的HPLC色譜圖

表2 3個成分的回歸方程、r值及線性范圍

2.7 重復性試驗

按“2.2.2”項下方法平行制備三七與黃連之比為1∶1的供試品溶液6份，在“2.1”項色譜條件下檢測。結果，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1平均溶出率分別為1.14%、3.46%、1.12%，RSD分別為1.98%、1.31%、1.51%(n=6)，表明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

平行量取1.0 mL含量已知的三七與黃連之比為1∶0供試品溶液，共9份，分別精密加入0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL“2.2.1”項下的混合對照品溶液制備加樣供試品溶液(每個濃度3份)，按照“2.2.2”項的方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進行分析，測定三者的含量，計算回收率，結果平均回收率分別為 97.3%、99.7%、102.2%，RSD分別2.96%、0.92%、1.97%，符合加樣回收規定。

2.9 數據處理與結果

2.9.1 有效成分溶出率

按三七-黃連藥對9個不同比例精密稱取藥材，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣20 μL，計算不同配比條件下3種有效成分的溶出率，結果見圖2～圖4和表3。圖2和圖3顯示，隨著藥對中黃連比例的提高，三七皂苷R1和人參皂苷Rg1的溶出率隨之增加；當三七和黃連的比例為1∶2時，三七皂苷R1和人參皂苷Rg1的溶出率最高，但隨著黃連比例的繼續增加，二者的溶出率迅速降低；圖4顯示，隨著藥對中黃連比例的提高，人參皂苷Rb1的溶出率隨之增加，當三七與黃連比例為2∶1時，人參皂苷Rb1的溶出率最高，隨著黃連比例的繼續增加，Rb1的溶出率隨之降低。當藥對比例為1∶3或1∶4時三者的溶出率都很低，均低于配伍前。

圖2 三七皂苷R1溶出率

圖3 人參皂苷Rg1溶出率

圖4 人參皂苷Rb1溶出率

2.9.2 總溶出率考察

以藥對中3個有效成分為考察指標，采用Hassan法進行“歸一化法”數據處理[9]，求得各指標“歸一值”，公式見(1)。其中Ymin為指標中最小值，Ymax為指標中最大值。

di=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin)

(1)

然后，對各指標的“歸一值”進行處理，得總評“歸一值”(Overall desirability，OD)，其值越大越好，公式見(2)，其中k為指標數，結果見表3。由表4可知，當三七與黃連比例為2∶1時，最有利于3種有效成分的溶出，其次是3∶1，而比例為1∶4時，三者的溶出率最差。

OD=(d1×d2…×dk)1/k

(2)

表3 不同配伍比例下3個成分的溶出率(n=3)

表4 不同配比下3種成分的OD值

3 討論

采用三七和黃連配伍輔助治療2型糖尿病是我科經驗方，臨床應用已有多年，療效確切，然而兩種藥材的最佳配比一直未從化學成分角度加以實驗考察。皂苷類成分是三七中的主要活性成分，目前從三七中分離出鑒定出的達瑪烷型皂苷多達70余個[10]，其中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1被《中華人民共和國藥典》列為三七藥材質控指標，因此，本研究選取這3個成分設置系列配伍梯度進行最佳配比的考察。據報道，三七中總皂苷的提取醇提優于水提，60%乙醇回流2 h提取最佳[11-12]。鑒于此，本研究在此條件下，設計了不同配比黃連三七中3個皂苷溶出率變化規律的考察實驗。

實驗結果表明，隨著藥對中黃連比例的增加，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的溶出率隨之增加，在達到各自最大溶出率后隨著黃連比例的繼續增加，溶出率然而降低。當藥對比例為1∶3或1∶4時三者的溶出率都很低，均低于配伍前。煎煮過程對中藥復方臨床應用和發揮藥效有重要作用，不同藥材在共同提取過程中化學成分之間可能發生助溶、揮發、水解、氧化、沉淀等復雜物理或化學作用，從而使某些化學成分的溶出增加、減少或消失，表現出不同的藥理活性[13]。中醫素有“不傳之秘在于量”的說法，藥量多少可影響其藥力，配伍的不同可影響其藥效[14]。三七的主要活性成分是皂苷類，黃連的活性成分主要是生物堿類，皂苷是一種很好的表面活性劑，往往對其他物質有助溶現象。這就提示三七對黃連中化學成分的溶出可能也有重要影響，在后續的實驗研究中將繼續探討。

據研究報道[15]，當實驗考察指標超過1個時，指標之間往往互相影響，對其中一項指標有利的方案可能不利于其他指標，最終確定的方案要依據所有指標的綜合效應。為了使3個考察指標之間具有加和性，筆者采用Hassan法進行“歸一化法”數據處理，然后對各指標的“歸一值”求幾何平均數得總評“歸一值”(Overall desirability，OD)，以OD值表達最終效應，從而將3個考察指標綜合起來。通過計算不同配伍比例條件下3種成分溶出率的總評歸一值，發現當三七與黃連配伍比例為2∶1時，三者的總溶出率最大，1∶4配比時，最不利于3個有效成分的溶出。三七-黃連配伍比例為2∶1較合理。

本研究通過比較黃連-三七藥對不同配伍比例三七中3個有效成分溶出率的變化，可以為黃連-三七藥對配伍化學本質的揭示提供依據，在下一步的研究中，將從藥效學視角[16-17]進一步考察，從而為臨床黃連-三七藥對的使用提供參考依據。