基于GC-TOFMS技術對痰濁壅肺型COPD急性加重期血清代謝組學研究

張瑞，張鳳云，黃雪元

(上海市嘉定區中醫醫院，上海 201800)

慢性阻塞型肺病 (COPD)是一種慢性非特異性炎癥性疾病[1]，“痰濁壅肺證”是COPD急性加重期(AECOPD)的最主要證型之一。中醫證候傳統研究手段缺乏客觀的診斷標準，使方劑療效難以正確評價。目前代謝組學廣泛應用于中醫藥證本質科研研究，本研究運用氣相色譜-飛行時間質譜聯用(GC-TOFMS)技術尋找中醫AECOPD“痰濁壅肺證”的生物學物質基礎，以期從系統生物學水平探討中醫“證”的本質，為臨床診斷、治療疾病提供客觀依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2017年4月—2019年4月上海市嘉定區中醫醫院門診及住院確診為COPD急性加重期，經中醫辨證為痰濁壅肺證的60例患者作為疾病組。其中男性患者30例，女性患者30例；年齡(65.83±7.75)歲；病情嚴重程度GOLD 2級36例，GOLD 3級24例；病程(16.88±6.09)年;BMI(22.13±3.21)kg/m2；合并高血壓者32例，2型糖尿病者33例，冠心病者21例。

本研究共納入同期在我院體檢中心的體檢的健康受試者30例作為對照，年齡60～80歲，男性15例，女性15例。

1.2 診斷標準

疾病組：西醫診斷標準及病情嚴重程度分級參照2016年GOLD診斷標準[2]；中醫診斷標準參照《中醫病證診斷療效標準》[3]。主證：咳嗽，喘息氣促，咳痰黏稠量多，色白或成泡沫狀；次證：喉間痰鳴，喘息不能平臥，胸部膨滿，憋悶如塞，納呆，脘腹脹滿，肢體困重，大便秘結或不暢；舌脈：舌暗，苔薄膩或濁膩，脈小滑。具備主癥及次癥中≥2項者，結合舌象、脈象，即可診斷。健康組：參照《中醫體質分類與判定》中平和質的判定標準[4]。

1.3 納入標準

符合上述西醫診斷標準同時符合肺脹病痰濁壅肺證中醫診斷標準的患者，患者氣流受限程度根據2016年慢性阻塞性肺疾病全球倡議[2](GOLD)納入GOLD2級、GOLD3級患者，能夠完成肺功能檢測，第1秒用力呼氣量(FEV1)%為30%～80%，吸入支氣管舒張劑后FEV1/用力肺活量(FVC)%<70%，年齡60～80歲，且病情屬于1周之內急性加重期，所有受試者均簽署知情同意書并經上海市嘉定區中醫醫院倫理委員會審查批準。

1.4 排除標準

COPD伴有呼吸衰竭同時需要機械通氣者；因肺部腫瘤、肺結核、支氣管哮喘、支氣管擴張、間質性肺病等原因導致的慢性喘咳患者；發病時有嚴重的心功能不全，肝、腎功能不全等諸臟器功能不全，造血系統疾病和精神疾病患者。

1.5 標本采集和制備

疾病組治療前24 h內于清晨6:00左右在室溫下釆取靜脈4 mL，血液樣本在室溫下自然凝固1 h，收集血清，留置于EDTA管中，3 000 r/min離心10 min后收集血漿置于1.5 mL Eppendorf管中，置于液氮萃取后轉運至-80 ℃冰箱中保存備用。

1.6 代謝物檢測和分析

代謝組學的檢測和分析與上海百趣生物科技有限公司共同完成，包括樣品的處理、GC-TOFMS測試和數據處理分析部分。

1.6.1 實驗儀器與試劑

儀器：Agilent 7890A GC-MS色譜儀(Agilent)；PEGASUS HT質譜儀(LECO)；DB-5MS色譜柱(Agilent)；Heraeus Fresco17冷凍離心機(Thermo Fisher Scientific)；Forma 900 series超低溫冰箱(Thermo Fisher Scientific)。

試劑：甲醇(CNW Technologies)；氯仿、吡啶、甲氧胺鹽、L-2-氯苯丙氨酸、BSTFA及各化合物標準品(Adamas)；FAMEs(REGIS Technologies)；純水由Merck Millipore系統制備。

1.6.2 樣品處理

100 μL血清加入4倍體積冷甲醇及再加入10 μL L-2-氯苯丙氨酸沉淀蛋白，離心取上清液低溫減壓干燥；各樣本分別取40 μL混合制備混合血清進行質量控制(quality control，QC)，按相同方法進行前處理；提取物用30 μL甲氧胺鹽試劑， 80 ℃孵育30 min后向每個樣品中加入40 μL BSTFA溶解，70 ℃孵育90 min；之后加入5 μL FAMEs(溶于氯仿)，隨機順序上機檢測。

1.6.3 分析條件

色譜條件：DB-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)色譜柱；進樣口溫度280 ℃，不分流模式，進樣量 1 μL，載氣(高純氦)流速為3 mL/min；柱箱升溫程序為50 ℃保持1 min后，以10 ℃/min升至310 ℃，保持8 min。

質譜條件：標準EI離子源,電離電壓-70 eV，離子源溫度250 ℃，在全掃描模式下采集數據，質量范圍(m/z)50～500，掃描速率12.5 spectr/s。

1.6.4 數據處理與分析

使用ChromaTOF軟件(V 4.3x，LECO)對質譜數據進行了分析，使用LECO-Fiehn Rtx5數據庫對物質定性，匹配質譜及保留時間指數，將QC樣本中檢出率50%以下或RSD>30%的峰去除。得到的峰表輸入Simca 15.0.2件進行主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)。然后進行置換檢驗對模型有效性做進一步檢驗，即隨機改變變量Y的順序得到不同的隨機Q2值。按照VIP(variable importance projection,VIP)>1，T檢驗(T-Test)P<0.05的條件進行篩選后，通過檢索在線數據庫(KEGG、HMDB、PubChem)定性可能的差異性代謝物。

2 結果

2.1 疾病組與健康組的PCA結果

比較樣本基本處于95%置信區間，疾病組與健康組主要成分得到了完全的分離，說明兩組間代謝物存在顯著差異；該模型主成分累計解釋率為R2X(cum)=0.473，說明建立的PCA模型可靠。詳見圖1。

注：R2X=0.473圖1 疾病組與健康組的PCA得分散點圖

2.2 疾病組與健康組OPLS-DA及對模型的驗證比較

疾病組和健康組的血清樣品OPLS-DA圖中，樣本處于95%置信區間，兩組樣本區分非常顯著，R2Y非常接近1，Q2非常接近1，表明當前模型較為真實可靠，可以解釋兩組之間的差異代謝物。置換檢驗建立對應的OPLS-DA模型獲得隨機模型的Q2值均小于原模型的Q2值；置換的Y變量比例增大，表面模型具有良好的穩健性，擬合良好。結果見圖2。

2.3 潛在證候標記物

對疾病組和健康組分組貢獻較大的重要變量因子VIP值進行提取，保留VIP>1的代謝物進行統計t檢驗，差異有統計學意義(P<0.05)的代謝物作為差異代謝物。利用KEGG、HMDB、PubChem等相關數據庫進行檢索，結果對代謝物鑒定和代謝通路分析后找到主要17種差異代謝物與本研究有重要貢獻，其升級趨勢等相關信息如表1所示，其中牛磺酸、蘇氨酸2種在疾病組中呈下降趨勢，其余15種呈上升趨勢，代謝差異物熱圖見圖3。

3 討論

慢性阻塞型肺病(COPD)歸屬“肺脹”范疇，古代眾多醫家認為COPD的發生多由久病肺虛,痰濁潴留,每因再感外邪誘使病情發作加重，病機以痰為根本。痰濁壅肺為急性加重期最常見證型之一，臨床表現上患者咳、痰、喘癥明顯加重，此階段患者咳吐痰濁較多。筆者前期基于“痰濁壅肺證”進行了一系列藥物療效觀察和藥物作用機制研究方面的研究[5]，但中醫證候缺乏明確統一的客觀化、量化指標，對臨床證型的統一造成了一定的障礙，也對臨床治療造成一定的困擾。

注：R2X=0.15，R2Y=0.98，Q2=0.958；截距：R2=(0，0.31)，Q2=(0，-1.57)圖2 兩組血清樣品OPLS-DA得分散點圖(左)和置換檢驗圖(右)

圖3 兩組代謝物的熱圖

表1 COPD急性加重期痰濁壅肺證潛在有重要貢獻的證候標志物及變化趨勢

注：mass表示物質特征離子的質荷比,VIP表示OPLS模型中代謝物變量的影響因子,fold Change表示該物質在該組對比兩組實驗間的倍數關系。

中醫證候反映了機體整體某一時刻的外在宏觀表現，而代謝組學從整體水平闡明了機體的內在微觀變化，更能揭示中醫證候的本質。在“精準醫學”的時代，眾多學者從代謝組學層面研究中醫證型實質研究上做出了大量有益的探索，取得了很多研究成果。痰熱壅肺型AECOPD主要和能量代謝和蛋白質代謝紊亂有關，患者血清中丙酮酸、3-羥基丁酸、賴氨酸、谷氨酸等明顯升高，而纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸等水平明顯下降[6]。COPD肺氣虛證檢測出13種物質存在變化，其中膽酸、羊毛固醇、脂肪酸等下降，2-羥基已二酸、甲羥戊酸、硬脂酰肉堿明顯升高[7]。多囊卵巢綜合征(PCOS)痰濕證患者和健康人的血清代謝物存在差異，13 種代謝物可能是 PCOS 痰濕證潛在的生物標志物，主要表現為三羧酸循環障礙、糖代謝緩慢、脂肪動員加強[8]。腫瘤患者體內脂肪代謝加強，多種氨基酸下降和脂肪代謝有關的代謝含量增加在痰瘀證腫瘤患者體內比非痰瘀證腫瘤患者嚴重[9]。中醫證候痰證較非痰證患者代謝組學檢測結果在糖代謝、脂肪代謝、氨基酸代謝等各方面均存在不同差異，在不同的疾病中亦各有側重。

基于GC-TOFMS技術對AECOPD痰濁壅肺證患者血漿樣本進行代謝組學研究，本研究結果篩選出17種有意義差異代謝物(包括氨基酸、脂肪酸、糖等)。血清中上調代謝物比較有意義的是乳酸、琥珀酸、硫辛酸、新橙皮苷、D-神經鞘氨醇、葡萄糖、亞油酸甲酯、天門冬酰胺、尿素等；下調物質中比較有意義的是牛磺酸、蘇氨酸。

目前普遍認為,AECOPD不僅與氣道炎癥有關，還是一個全身系統性炎癥，筆者前期的研究結果已證明AECOPD患者血液中某些炎癥因子水平顯著升高[5]。炎癥反應部位使物質分解加速,加重組織耗氧，同時炎癥反應部位微循環障礙影響氧供，引起無氧酵解產生乳酸量增多。同時COPD 病人因長期處于氧供不足的狀態，糖酵解亦產生乳酸增多。琥珀酸是TCA中的中間代謝產物，在線粒體生成ATP的過程中起關鍵作用，亦可作為炎癥中的一種物質代謝信號, 促進炎癥[10]。硫辛酸屬于B族維生素中的一類化合物，在催化α-酮戊二酸氧化脫羧成琥珀酸的反應重起轉酰基作用，能增強AECOPD患者抗氧化能力, 減輕氧化應激水平, 降低相關炎癥因子水平, 起到抗炎、抗氧化作用, 從而改善肺功能[11]。新橙皮苷在是一種天然的強抗氧化劑，具有抗炎的作用[12]。D-神經鞘氨醇是神經鞘磷脂類成分，是形成生物膜的重要脂類成分。神經鞘氨醇相關物質可結合腫瘤細胞或炎癥細胞表面的受體,增強其下游的IL-6表達,增強炎癥反應，含量增高可能導致炎癥反應風險增大[13]。以上物質水平增高均提示炎癥反應增強及其導致機體自身抗炎能力得到發揮。牛磺酸是一種抑制性神經遞質，具有抗炎、抗氧化應激、調節胞內鈣、調節滲透壓以維持細胞膜的穩態[14]。氧化應激與炎癥高度相關，AECOPD患者牛磺酸含量降低，可能與 COPD病人氧化應激增強，牛磺酸消耗程度較高相關。

基于代謝組學方面，機體的能量代謝過程是伴隨著物質的徹底氧化分解過程。天冬酰胺可以與天冬氨酸相互轉化，天冬氨酸是合成延胡索酸(三羧酸循環中間體)的前體物質[15]，并可作為底物生成的谷胱甘肽和草酰乙酸,具有抗氧化功能并與琥珀酸參與三羧酸循環，提供能量。機體主要是利用血液提供的葡萄糖供能，葡萄糖、木糖、麥芽糖等葡萄糖代謝物增多及琥珀酸等三羧酸循環代謝中間體的上調表明了COPD急性加重期急性炎癥反應和氧化應激使機體能量代謝處于比較旺盛的狀態。同時隨著炎癥反應產生機體能量代謝需求增加，脂肪的代謝增加。D-神經鞘氨醇、亞油酸甲酯、4-羥基丁酸乙酰酯等脂質及分解產物呈現出顯著的上調，提示脂肪酸代謝發生紊亂。氨基酸的代謝紊亂主要體現在尿素生成增加及蘇氨酸的下調。尿素是蛋白質代謝的主要產物，炎癥反應時尿素水平的升高可認為是炎癥狀態下蛋白質的分解代謝增強所致。蘇氨酸是一種必需的氨基酸，參與動物的免疫調節和增強腸道黏膜屏障功能[16]。蘇氨酸的含量相對減少, 說明AECOPD患者免疫力相對較低下, 正是COPD患者因為免疫下降才導致病情反復加重。

本研究證明伴隨著體內炎癥反應，AECOPD痰濁壅肺證患者血清代謝譜發生了特異性變化，能量代謝、脂肪代謝、氨基酸代謝發生了紊亂，鑒定出的差異代謝物及相關代謝通路可以為更深入的研究中醫證本質提供參考依據。