知母多糖的研究進展

賈小舟，張子東，何建鑫，匡海學，王秋紅*

(1.黑龍江中醫藥大學，北藥基礎應用與研究教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040；2.廣東藥科大學，廣東 廣州 510006)

知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.)為百合科知母的干燥根莖[1]。于春季和秋季采挖，除去其根須和表面附著泥沙，后曬干，習稱“毛知母”[2]；或除其外皮并曬干[3]。其味苦、甘，性寒，歸肺、胃、腎經，具有清熱瀉火、生津潤燥的功效[4]，主要用于治療外感熱病，內熱消渴，骨蒸潮熱，肺熱燥咳，高熱煩渴，腸燥便秘等癥[5]。知母作為臨床常用藥材歷史悠久，是常用中藥復方的組成部分，其活性成分主要包含有甾體皂苷類[6-7]、雙苯吡酮類[8]、黃酮類、有機酸類、木脂素類、多糖類和微量元素等[9]。知母皂苷類成分以甾體皂苷的數量最多，含量最高，而知母中含有最多的成分為多糖組分，是知母的重要物質組成[10]。以往對知母的研究大多關注知母原藥材的小分子，近年來國內外學者對知母活性成分之一——糖類化合物進行了深入研究，結果發現知母多糖具有明顯的降血糖作用、抗炎作用和抗氧化的功能[11-12]?，F通過收集近年來知母的研究論文進行分析，從知母多糖的提取分離純化、化學成分和藥理作用分別進行介紹。

1 提取分離純化

多糖提取的原料一般采用傳統中藥或一些待研究植物的干品，將其粉碎過篩，烘干備用。目前多糖的種類繁雜，存在于植物的部位也各不相同，因此，提取方法因目標物的不同而不同。常用的多糖提取方法有水提、堿提、超聲抽提以及其他提取劑的提取[13-14]。采用上述提取方法獲得的多糖提取液，都含有許多雜質，主要是無機鹽、單糖、寡糖、低分子量的非極性物質、高分子量的有機雜質(如蛋白質、木質素)及一些色素[15]，因此，需要對其進行純化[16]。常采用的純化方法有透析法、凝膠色譜法、超濾法[17]。常用的除蛋白的方法有Sevag法脫蛋白，Sevag法結合酶法脫蛋白[18]，三氯乙酸法、酶解法、鞣酸法等。常用的脫色方法有吸附法、氧化法、離子交換法、金屬絡合物法等[19]。常采用離子交換柱層析、分子篩排阻層析、有機溶劑沉淀法進行分級純化[20]。

王靖等[21]將知母浸泡后得到勻漿后用溫度75 ℃蒸餾水進行水浴，離心，上清用乙醇分級醇沉，依次用95%乙醇、無水乙醇、乙醚依次洗滌沉淀物，將沉淀物真空干燥后即為知母粗多糖。黃芳等[22]將知母按料液比1∶10水煎煮2次/h進行提取。合并提取液過濾后濃縮，濃縮液加入高濃度乙醇，使乙醇濃度達到70%，進行分級沉淀得到粗多糖。利用 Sevag法去除蛋白質得到知母總多糖。李炳輝等[23]基于單因素的基礎上進行響應面法試驗，對知母多糖的理論得率進行預測，確定知母多糖提取的最佳工藝參數：液料比11 mL/g，提取2次，提取時間117 min，提取功率92 W，理論上知母多糖得率可達30.18%。

2 化學成分

多糖是一類由醛糖或酮糖通過糖苷鍵連接而成的天然高分子多聚物，與蛋白質和核酸相比，多糖的結構更為復雜，可稱之為最復雜的生物大分子。糖的結構沿用了蛋白質和核酸的分類方法，可分為一級、二級、三級和四級。在多糖的結構分析中，一級結構是最重要的，二級～四級結構與多糖的生物功能及其構效關系有著十分重要的關系[24-26]。

知母多糖類成分在知母中占有相當大的比例，但由于研究水平和技術條件的限制，多糖結構鑒定非常困難。目前結構特征較明確的知母多糖主要有知母多糖A、B、C、D，其分子量分別為1.2×106，6.0×104，2.4×104，6.5×104，經酸水解后，知母多糖A含有Rha、Ara、Xyl和Gal，知母多糖B含有Rha、Ara、Xyl和Glc，知母多糖C含有Fuc、Ara、Xyl、Gal和Glc，知母多糖D含有Man和Glc[27]。

王靖等[21]從知母中分離純化得多糖PS-Ⅰ精品，分子量約為190萬，單糖組成為D-甘露糖和D-葡萄糖。呂太勇等[28]分離純化得AAB1精品，經HPLC、比旋光度測定等方法，AAB1為均一酸性雜多糖，分子量約為5.47×104，經氣相色譜分析，表明AAB1由D-木糖(Xyl)、Man、D-半乳糖(Gal)、半乳糖醛酸(GalA)和Glc組成，摩爾比為1∶11∶1.75∶7.92∶1.2。楊東升[29]以地道藥材“西陵知母”為研究對象測得知母總多糖的含量為14.33%。分離純化后成功得到知母均一多糖，中性多糖A-1，酸性多糖B-1，B-2。分子量分別為201 000、41 100、10 500。筆雪燕[30]經氣相色譜分析分離并鑒定了4種均一糖，AAP3(Rha：Fuc：Ara：Man：Glc摩爾比為38.92∶1.55∶9.26∶2.28∶9.64)，AAP4(Rha：Fuc：Ara：Man：Glc糖摩爾比為31.86∶3.27∶18.4∶1.99∶7.18)，AAP5(Rha：Ara：Man：Glc糖摩爾比為38.23∶3.59∶32.06∶0.99)，AAP6(Rha：Ara：Man：Glc糖摩爾比為31.11∶3.48∶38.23∶2.82)。周曉歡[31]利用離子交換和凝膠層析對知母酸性總糖進行了分離純化并得到5個不同級分WABP-A2a(975 KDa)、WABP-A2b(104 KDa)、WABP-A2c(3 KDa)、WABP-A3a(1 013 KDa) 和 WABP-A3b(26 KDa)。采用甲基化分析、紅外光譜分析、核磁共振對均一級分WABP-A2a、WABP-A2b和WABP-A3a進行了單糖組成測定。這3個部分被證明為連有較多的中性糖側鏈的RG-Ⅰ型果膠結構域。側鏈中的糖苷鍵主要類型包括α-1，5-Ara，其中部分Ara的O-3位置被取代，t-Ara鏈接，高度支化，還含有AG-Ⅰ型果膠側鏈中的β-1，4-Gal，WABP-A2b中還含有β-1、6-Gal、β-1、3,6-Gal，以及少量的AG-Ⅱ側鏈。采用紅外光譜、核磁共振、果膠酶酶解對均一級分WABP-A2c和WABP-A3b進行單糖組成測定，證明WABP-A2c和WABP-A3b的結構中主要為HG型果膠，以及少量的RG-Ⅰ和RG-Ⅱ結構域。三種結構域在WABP-A2c和WABP-A3b中具有不同的比例，并通過共價鍵進行連接。

3 藥理作用

多糖是一種高分子碳水化合物，通過糖苷鍵連接起來的長鏈，由多個單糖單元組成[32]。隨著分子生物學的發展，人們逐漸認識到多糖同蛋白質[33]、核酸一樣都是非常重要的生物大分子，在生物體的生長和發育上發揮重要作用[34]。目前學界對于多糖活性[35]相關研究主要集中在抗病毒、抗氧化、降血糖、抗腫瘤、免疫調節等方面[36-37]?？寡趸譃橐詣游锬Ｐ蜑榛A的體內活性評價及基于化學及儀器分析方法的體外模型評價，調節免疫活性[38-39]是以通過激活巨噬細胞，激活T淋巴細胞及B淋巴細胞。降血糖活性主要通過多糖調節胰島素并影響糖代謝中的酶活，使組織對葡萄糖的產生作用，從而調節血糖含量，對糖尿病的防治和治療有一定幫助[40]。目前學者的研究重心大多集中在皂苷及苷元類上[41]。

3.1 抗炎作用

知母總多糖可以顯著改善由二甲苯引起小鼠耳廓腫脹和醋酸導致小鼠腹腔毛細血管通透性增高引起的炎癥反應[42]。陳萬生等[43]通過實驗證明模型證實知母總多糖對炎性滲出增加及組織水腫、急性毛細血管通透性增高等由多種致炎劑引起的一系列反映均有明顯的抑制作用。對慢性肉芽腫增生有顯著抑制作用。知母總多糖通過抑制前列腺素E的合成或者釋放，從而使炎癥組織中PGE顯著減少。雷霞等[44]通過DNFB誘導小鼠遲發型超敏反應(DTH)模型證實知母多糖組分能顯著降低耳腫脹度，抑制T細胞增殖;調節Th1/Th2的平衡，抑制細胞免疫應答，減輕耳部炎癥與免疫損傷;抑制LPS誘導的單核巨噬細胞炎癥反應，抑制TNF-α和NO釋放，呈現出抗炎的功效。

3.2 降血糖作用

知母藥材是為常見的中藥材，現代臨床上人們多用于治療糖尿病[45]。Kimura等[46]采用口服給藥進行研究降血糖方面的研究。王靖等[47]實驗研究發現知母多糖具有明顯的降血糖作用，無論是灌胃還是腹腔給藥，均能降低正常小鼠和四氧嘧啶型小鼠的血糖；也能降低正常小鼠肝糖元的含量。知母多糖抑制α-糖苷酶可能是降低糖尿病模型家兔和小鼠血糖的作用機制。陳麗華等[48]研究報道了知母多糖對α-葡萄糖苷酶的活性隨時間的變化先激活后抑制。孫洪偉[49]改進提取工藝得到較純的知母聚糖。證實了知母聚糖對胰島D細胞受損有修復作用。使用四氧嘧啶誘導糖尿病大鼠模型(該模型類似于1型糖尿病)，實驗結果表明，知母聚糖可以提高鼠骨骼肌對血液中葡萄糖的攝取能力。2型糖尿病的重要特征是骨骼肌對葡萄糖攝取障礙，由此推斷出知母聚糖不僅僅對1型糖尿病發揮作用，同樣對2型糖尿病也是有降血糖作用。盧盛華等[50]提取了知母中知母聚糖A、B、C、D的混合物，研究得出知母聚糖能降低正常小鼠和糖尿病大鼠(四氧嘧啶誘發)的血糖，增高肝糖原含量、增加骨骼肌對3H-2-脫氧葡萄糖攝取能力，同時可以減輕四氧嘧啶造成的胰島組織的損害，其降血糖作用與增加骨骼肌對3H-2-DG攝取、減少肝糖原分解、增加肝糖原合成、使尚未遭到嚴重損害的胰島β細胞恢復正常有關。黃彩云等[51]研究發現,知母多糖可降低家兔糖尿病(四氧嘧啶型)的血糖，知母多糖反而對正常家兔的血糖影響比較小，與D860(甲苯磺丁脲)相比，作用時間快，持續時間短。降血糖的機理可能與增加葡聚糖的利用有關，促進脂肪組織對葡聚糖的攝取，使血糖降低，從而產生降血糖作用。姚桂香[52]從知母根莖中分離得到的知母聚糖A、B、C、D具有降血糖作用，其中B的活性最強。朱建成等[53]建立大鼠紅細胞磷脂的代謝組學判別模型，綜合運用多種統計學分析方法尋找知母多糖治療2型糖尿病的紅細胞磷脂藥理標志物。通過交叉檢驗及置換檢驗證明，模型可以充分提取組間差異，并具有較好的預測能力。篩選得到的知母多糖紅細胞磷脂標志物可為后續的作用機制研究提供參考。劉印等[54]研究了知母多糖可以增加大鼠體質量，并改善對葡萄糖的耐受能力;降低FBG水平，提高FINS水平；也可以降低模型大鼠血清IL-6、TNF-α水平及肝組織MDA含有量，提高肝組織CAT、SOD活性，同時，知母多糖還可以減少肝組織Phospho-IRS1表達，增加Glut4表達。侯紅瑞等[55]研究分子量在30～100 kDa知母多糖對鏈脲佐菌素(STZ)致糖尿病SD大鼠的降血糖效果及其機制，發現對糖尿病SD大鼠的有明顯的降血糖、降血脂效果，該作用機制可能與改善胰島素抵抗和修復受損胰島細胞組織有關。

3.3 抗氧化作用

3.4 其他作用

盧盛華等[50]研究發現知母多糖可以用作醛糖還原酶抑制劑，以緩解糖尿病的并發癥。醛糖還原酶在糖性白內障的發病中起著至關重要的作用，還與糖尿病引起的一系列病變有關，例如角膜、視神經及外周神經的病變[59]。雷霞等[60]對知母鹽炙前后水煎液通便作用及化學成分進行比較研究，通過觀察生知母、鹽知母水煎液對便秘大鼠的通便作用，糖類化合物可能是其滋陰降火作用的物質基礎，也是知母甘味的物質基礎。

4 結語

現階段對知母的質量評價[61]及其藥效研究主要集中在皂苷類和黃酮類等成分上，究其原因，主要是國內目前對知母多糖的分離和純化缺乏系統的研究[62]?；瘜W結構明確、純度較高的知母多糖對照品也將成為影響知母藥材質量標準提高和完善的一個極其重要的因素。多糖及共綴合物的研究可以追溯到100多年前，在生物化學領域，由于人類的不斷努力，在微觀細胞水平上逐漸進行了有關活性多糖的機理機制研究，在研究較成熟的多糖(香菇多糖)已有了分子水平的發現[63]。對多糖類的研究雖然也取得了一些巨大成就，但與蛋白質和核酸的研究相比，多糖類的研究還不夠深入，還具有很大差距，任重而道遠。