化學小分子靶標鑒定方法的研究進展

2020-04-22 09:55:44陳杰波蔡軍

醫學綜述 2020年7期

關鍵詞：方法

陳杰波，蔡軍

(1.上海交通大學醫學院，上海200025； 2.上海交通大學醫學院病理學系，上海200025)

化學小分子作為藥物用于治療和預防疾病已經非常普遍。小分子藥物進入細胞或組織后與相關靶標結合，引起細胞或組織的一系列反應，調節細胞或組織的功能和代謝，從而達到治療和預防相關疾病的目的。化學小分子靶標的鑒定是生物化學研究的重點。隨著以基因組學、蛋白質組學、生物信息技術以及比較分析為基礎的研究方法的發展，近年來化學小分子靶標的篩選和鑒定發展迅速。目前所發現的靶標多數為蛋白質，包括激酶、蛋白酶、受體、離子通道等。

靶標發現與確證的一般流程是：首先獲取疾病相關生物分子信息，然后研究這些分子的功能以確定藥物靶標，最后針對靶標設計化合物進行有效性驗證[1]。目前，化學小分子靶標的鑒定在生物醫學領域越來越重要，其鑒定方法也多種多樣，各具優劣[2]。當前應用的鑒定方法既有獨立性，又有互補性，其結合運用可能更加有利于化學小分子靶標的鑒定。現就化學小分子靶標鑒定方法的研究進展進行綜述。

1 以基因組學為基礎的鑒定方法

基因組學方法主要分析化學小分子對基因組表達水平的影響，獲得小分子作用的特征表達譜，通過分析確定分子靶標。但由于基因表達與蛋白質表達之間的對應關系存在一定的不確定性，不能直接確定藥物靶標，因此存在一定的局限性。

1.1基因芯片技術基因芯片技術在DNA測序、基因表達分子與基因調控機制研究、基因藥物設計與篩選等方面應用廣泛[3]。Sun等[4]從8例乳腺癌患者的癌組織以及癌旁組織中提取RNA，并分離微RNA(microRNA，miRNA)，利用基因芯片技術和雙重熒光法，通過分析檢測正常組織和癌細胞中miRNAs的差異表達，獲得miRNAs乳腺癌表達譜，并進一步確定程序性細胞死亡因子4和程序性細胞死亡因子10分別是miR-21和miR-200c的靶標。郭秋云等[5]對膠質母細胞瘤基因芯片數據進行生物信息學方法分析，從轉錄水平探討膠質母細胞瘤與正常組織差異表達基因的功能和相互作用，為進一步研究膠質母細胞瘤的發生發展機制及尋找潛在的藥物治療靶點提供依據。

1.2特征基因及人工構建菌株基因表達譜存在較多無效信息和干擾信息，通過一定的選取可發掘在相應組織(如腫瘤組織)中特異表達的基因和藥物治療的靶序列。特征基因集合建立后，聯合人工構建菌株技術，用這些基因構建相關預測菌株，這些預測菌株的基因表達可直接揭示相關藥物的作用機制。近年來，基因組測序技術的發展促進了高通量研究，由于對酵母的生理學特點較為清楚，且酵母具有繁殖周期較短等特點，使酵母迅速成為尋找新藥和研究藥物作用機制的重要工具[6]。

Hoon等[7]通過結合多拷貝抑制分析(主要基于小分子靶標的過表達會增加對該藥物的耐受性這一假設[8])將藥物引導的單倍劑量不足分析和純和性缺失分析置于一個微陣列上。Hoepfner等[9]利用這個方法確定了枝孢菌素的靶標。近年來，分子條形碼技術也得到了發展，從以微陣列為基礎的分析到下一代測序，使得單倍劑量不足分析和純和性缺失分析的數據分析更加靈敏、動態范圍更大、檢測范圍更廣[10]。

1.3生化抑制策略在基因組中，由一個基因突變引起的表型改變可被其他基因的過表達消除，該現象是生化抑制策略的基礎。生化抑制策略是用化學抑制劑作為“突變基因”，而其他部分純化的蛋白混合物作為一種“過表達蛋白”，以此研究相關化學抑制劑的作用方式與靶標。Peterson等[11]將該策略應用于鑒定pirl1的靶標發現，過表達的Arp2/3阻止了pirl1的抑制作用以及細胞分裂周期蛋白42的過表達對pirl1無影響，可能是下游產生抑制作用。生化抑制策略雖可用于確定抑制性靶標以及信號通路中的其他化合物，但也有其局限性，僅可應用于可融合可片段化的蛋白質，該方法并不適用于對疏水性蛋白質的研究[12]。

2 以蛋白質組學為基礎的鑒定方法

蛋白質組學主要是尋找小分子作用的蛋白質，分離純化，由此確定小分子的靶標，為其作用方式提供直接證據。

2.1蛋白質差異表達的應用化學小分子作用前后細胞蛋白質的種類和數量發生了變化，通過對差異表達的檢測可以估計小分子的作用方式，篩選出相應靶標。

2.1.1熒光差異二維凝膠電泳技術相對于普通凝膠電泳，熒光差異二維凝膠電泳技術可在一塊聚丙烯凝膠上直接比較兩種蛋白質樣本，避免了兩塊凝膠比較時可能產生的系統誤差。此外，可以定量分析大量修飾過的蛋白，提供結構和翻譯后修飾信息，使重要生物系統變化的鑒定和蛋白功能闡述得以實現；同時可以定量分析截短的或部分降解的蛋白質[13]。但由于疏水蛋白、膜蛋白以及等電點或極端大或小分子量的蛋白質難以保持溶解狀態，因而難以用此方法鑒定。此外，熒光差異二維凝膠電泳技術難以區分具有相似分子量和等電點的蛋白質。

2.1.2色譜共洗脫配體-靶標復合物在高效液相色譜共洗脫加上配體-靶蛋白結合導致化合物色譜滯留時間的特征性轉移，從而可用高效色譜液相法-質譜/質譜法來確定靶蛋白[12]。

Chan等[14]用色譜共洗脫鑒定Erg6p(一種甾醇類生物合成酶，是抗真菌試劑的靶蛋白)，同時鑒定了多巴胺受體激動劑(A77636)的脫靶蛋白。運用色譜法后，實驗雖然免去了對化合物或蛋白質進行固定或標記，但是由于實驗需要分離未結合和結合的化合物，導致共價結合物被排除在外。此外，實驗中需要溶解較多的靶蛋白，使藥物和靶蛋白的反應受到限制。

2.2蛋白質親和特性的應用親和純化是利用生物分子間的特異性結合進行蛋白質的分離和純化。目前的親和純化技術主要有親和層析技術、串聯親和純化法、細胞培養穩定同位素標記法、小分子探針以及蛋白質芯片技術等。

利用蛋白質親和特性研究藥物與靶蛋白的結合，需要對藥物分子進行構效關系研究，但無需了解藥物與靶蛋白之間可能發生的某些特定的細胞或生化反應，研究可能受藥物小分子衍生產物的限制[15]。此外，合適的作為陰性對照的化學小分子藥物也較難得到。

2.2.1細胞培養穩定同位素標記法細胞培養穩定同位素標記法是在細胞培養過程中利用穩定同位素標記的氨基酸結合質譜技術對蛋白的表達進行定量分析的一種體內代謝標記技術。目前標記的氨基酸的種類已擴展到亮氨酸、精氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸以及酪氨酸等[16]。作為體內代謝標記技術，其標記效率高,不需要對樣品進行預處理，具有高通量性，且樣本需求量少、操作簡單、定量精確，適用于大分子量、復雜生物樣品的分析，可以鑒定出更多低豐度蛋白，包括細胞表面蛋白、細胞器特異性蛋白、磷酸化蛋白或糖蛋白等經翻譯后修飾的蛋白。此方法也具有一定的局限性：①實驗中需要將單個蛋白分離純化，導致誤差較大[17]；②不相關的共洗脫的離子發生同位素聚集，使定量分析復雜化；③為了保證同位素標記的氨基酸混合的完整性，限制使用處于高水平復制的細胞；④不能使用人體或其他組織樣本。

2.2.2小分子探針小分子探針主要由報告基團、連接基團以及活性基團組成，作用原理是小分子活性基團部分與靶標緊密結合，而報告基團部分可有效標記靶標生物大分子，之后可通過親和層析、凝膠電泳和質譜分析等手段確認靶標蛋白。傳統探針要求探針分子與靶蛋白不可逆結合，但由于報告基團體積較大，有可能阻礙細胞對探針的吸收，影響探針的分布及其親和力，故出現了不帶報告基團的bio-orthogonal探針，先用不帶報告基團的探針與靶標蛋白共價結合，再通過bio-orthogonal反應將被標記的蛋白與報告蛋白連接，避免因報告基團(生物素、熒光基團等)體積過大而影響探針分子在細胞內的分布以及對靶標的親和力，方便在活細胞內的研究。

小分子探針確定靶標具有一定的局限性：①細胞內豐度低或與探針結合力弱的蛋白難以鑒定；②探針與雜蛋白非特異性結合具有一定的干擾作用，采用高強度洗脫和陰性對照可消除一定的影響；③需要對化合物進行構效分析，且合成的探針分子應保持原有的生物活性和作用機制，所以工作量大且需要豐富的醫藥化學專業知識；④為了將化合物與連接鏈和報告基團連接,通常還需要在化合物母核上引入氨基、羥基、羧基等官能團,這些基團的引入可能對化合物的活性產生影響[15]。

2.2.3蛋白質芯片技術蛋白質芯片技術是將一個蛋白質庫以二維可設定位置的網格格式固定在一個載玻片或芯片上，可測定親和力低和含量低的蛋白質。由于蛋白會變性，因此在蛋白質芯片的制造過程中要保證蛋白的構象和功能，并且要表達和純化大量正確折疊且有活性的蛋白，蛋白質芯片耗時長，實驗要求高，制造難度遠遠高于基因芯片。根據實驗樣品的添加順序，蛋白質芯片技可分為正相芯片技術和反相芯片技術。正相芯片技術具有高特異性，但十分耗時，且需要大量的蛋白質探針[18]；反相芯片減少了檢測蛋白質抗原所需的抗體探針的量，但對于相對低濃度樣本中靶蛋白的敏感性降低[19]。

近來一些新的蛋白質微陣列技術如巨磁阻檢測芯片技術(靈敏度高，巨大磁抗性傳感器定量分析并用磁納米微粒標記)，蛋白直接由微陣列上的核酸進行表達的核酸可控蛋白芯片技術(龐大的蛋白庫)[19]等也逐步被應用。

2.3蛋白質穩定性的應用基于靶蛋白與小分子結合后穩定性變化，包括抗酶解活性、熱穩定性等，發展出了一系列小分子靶標的篩選鑒定方法。

2.3.1蛋白質抗酶解活性小分子化合物的結合可能會掩蓋蛋白酶的剪切位點或結合小分子后的靶蛋白局部或整體構象的穩定性增加，對蛋白酶的易感性下降，導致結合小分子的靶蛋白可能較未結合狀態的靶蛋白不易被蛋白酶降解[12]。基于這個原理，發展出藥物親和反應靶標穩定性(drug affinity responsive target stability，DARTS)研究方法。細胞裂解液與小分子化合物混合[20]，裂解液中蛋白質被嗜熱菌蛋白酶和鏈霉蛋白酶裂解，通過免疫印跡法分離出因為與小分子結合而未被裂解的蛋白質，最后進行質譜分析，確定靶蛋白[21]。

相對于親和色譜分析法，DARTS實驗中小分子化合物不需要經過構效分析或對配體進行化學修飾[20]。Lomenick等[15]提出，未來可以聯合使用DARTS與多向蛋白質鑒定技術，進一步增加實驗檢出靶蛋白的靈敏度。

2.3.2氧化速率的蛋白穩定性(stability of proteins from rates of oxidation,SPROX) SPROX與DARTS類似，DARTS利用的是蛋白質不同的水解特性，而SPROX利用的是不同的折疊狀態和熱力學穩定性。小分子化合物與靶蛋白結合后可能對靶蛋白的折疊狀態以及熱動力學穩定性產生影響而使靶蛋白發生變化[22]。一定時間和一定濃度的化學變性劑存在時，蛋白質的甲硫氨酸殘基只發生部分氧化，不同折疊狀態的蛋白質氧化程度不同，即可以通過氧化速率反映蛋白質的不同折疊狀態。

SPROX具有一定的局限性：①只能準確檢測樣本中含量較高的蛋白質靶標。②只有含有甲硫氨酸的蛋白質才適用這個方法，即使含有甲硫氨酸，也并非所有的甲硫氨酸殘基都會展現出不同的氧化速率足夠用來確定熱動力學穩定性的改變[15]。

2.3.3蛋白質熱穩定性 Martinez Molina等[23]將臨床藥物作用于細胞裂解液中4個不同的靶蛋白時發現，所有的靶蛋白都有其獨特的熔解曲線，當已知可結合到這些蛋白上的藥物加入細胞裂解液中，可以觀測到明顯的熔解曲線移動，根據這一原理開發出細胞熱轉移(cellular thermal shift assay，CETSA)方法，其可以直接測量藥物到達靶細胞的程度，檢測小分子在細胞裂解液甚至完整細胞組織中的作用。

CETSA適用范圍廣，可在細胞水平和動物水平直接測量藥物分子是否到達作用靶點，驗證了重要的臨床藥物靶標。根據藥物在體內和體外與靶標結合時間、結合程度的差異，可進一步研究小分子藥物在體內轉運激活的過程。Savitski等[24]通過對人K562細胞進行熱力學蛋白質組分析，觀察到完整細胞和細胞裂解液的熔解特性存在差異，用抑制劑十字孢堿和GSK3182571驗證了蛋白質組分析的可行性。同時確定了亞鐵血紅蛋白生物合成酶亞鐵螯合酶是多種激酶抑制劑的脫靶蛋白，進一步解釋了原卟啉癥患者畏光的可能原因。此外，采用此方法研究發現，藥物達沙替尼導致了慢性髓系白血病BCR-ABL信號通路下游蛋白的熱轉移[24]。

CETSA也有局限性。CETSA的蛋白熔解曲線是基于靶蛋白與小分子結合后熱穩定性增強這一特性建立起來的，而大的蛋白質包括蛋白質復合物有可能沒有這種小分子引起的反應或者反應微弱。此外，加熱可能會導致小分子與血漿蛋白結合和細胞通透性改變等，所以應盡可能地縮短加熱時間，減少樣本量或徹底改變樣本幾何學特性以及加熱裝置以改善熱傳遞。另外，若小分子參與細胞快速反應信號通路，則有可能影響蛋白的翻譯后修飾，所以細胞與小分子化合物的預先孵育時間會影響抗體對靶蛋白的檢測能力[25]。一些蛋白質的配體結合位點的結構域未折疊，也無法通過CETSA進行靶標鑒定[22]。

3 基于克隆擴增的鑒定方法

3.1三雜交系統目前主要有兩種三雜交系統：酵母三雜交系統和哺乳動物三雜交系統，前者是在酵母中進行，后者是在哺乳動物中進行[26]。在三雜交系統中，DNA結合域與轉錄激活域的相互作用是通過小分子化合物的橋聯完成的，互補DNA編碼的靶蛋白可直接通過這種方法進行分離鑒定。但未正確折疊和轉錄后修飾的靶蛋白、膜結合蛋白和部分蛋白質復合物無法鑒定，并且雜交的配體必須能夠進入酵母細胞并保持活性。

3.2顯示技術顯示技術包括噬菌體顯示法和mRNA顯示法等。噬菌體由于對其配體的特異親和性而不斷得到富集，因此噬菌體顯示法可檢測微弱表達的蛋白，并能確定其亞結構域與結合的關系。但有些蛋白質功能的實現需要折疊、轉運等，導致無法在噬菌體中獲得表達，限制了噬菌體顯示法的應用。

mRNA顯示法是將mRNA與其編碼的多肽用嘌呤霉素連接融合，該融合物被純化，經過逆轉錄得到cDNA以進一步擴增、表達，之后與固定于固相載體上的小分子共同孵育以鑒定。但在表達、克隆及顯示的過程中產生的多肽大多具有毒性，因此mRNA顯示法同樣存在局限性。

4 其他鑒定方法

4.1比較分析研究的鑒定方法隨著用小分子處理細胞得到的可用數據逐漸增多，化合物的特有“指紋”如基因表達、蛋白組譜、表型的多參數分析、細胞毒性數據的收集成為可能，由此形成的數據庫可通過相似性比較，識別當前小分子的靶標，其是目前最有效的識別藥物靶點的方法之一[12]。

4.2副作用報告系統的鑒定方法化學小分子靶標的鑒定不僅可用于闡明相關化合物的作用方式，也可用來識別所謂的“脫靶”蛋白，即化學小分子作用的靶標以外的蛋白。藥物小分子與“脫靶”蛋白結合，產生不良反應甚至生物毒性。Takarabe等[27]利用副作用報告系統定義了所有藥品的藥理學相似性，同時運用靶蛋白基因組序列的相似性發明了一種可以在大范圍預測未知藥物——靶標反應的方法，特別是針對那些無法預知藥物化學結構的未知反應，并對1 874種有已知靶標的藥物的“脫靶”蛋白以及2 519種靶標未知的藥物的可能靶標進行了綜合性預測。

5 小結

化學小分子靶標的鑒定方法在藥物研發和化學小分子作用機制的研究中發揮重要作用。相對于根據可能的靶標對下游物質產生效應進行推測的方法，直接鑒定更加準確。新近的研究技術，包括高通量的掃描[28]、高靈敏度的質譜分析[29]、化學探針、正電子發射斷層成像技術、體內生物熒光成像技術[30]等的發展促進了靶蛋白的分離和鑒定。