血清標志物在肝細胞肝癌早期診斷中的研究進展及應用前景

劉毓鍵，馬明洋

(天津醫科大學總醫院普通外科，天津 300052)

我國是肝癌高發地區之一，受肝炎病毒感染、黃曲霉素、飲酒、非酒精性脂肪肝、肥胖等危險因素的影響，我國肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的發病率居高不下，占世界總發病人數的55%，是我國發病率排在第四位的惡性腫瘤[1]。肝癌的惡性程度高，病死率高，預后差，主要原因是肝癌早期臨床癥狀隱蔽、影像學檢查不易發現(對于早期肝癌，超聲檢查的靈敏度僅為63%)，往往確診時病情已達中晚期，導致治療后復發率極高，嚴重威脅患者的生命[2]。目前對于肝癌的治療，最有效的是肝癌早期手術，且早期診療患者的5年生存率超過70%，遠高于肝癌晚期患者(低于16%)[3]。因此，提高早期篩查診斷效率，早發現、早診斷、早治療，是提高患者生存率、延長生存時間的有效途徑。肝癌的檢測主要包括活組織檢測、血清學檢測、影像學檢查，其中，血清學檢測具有便捷、經濟、傷害小、操作性強等優點，有較大的臨床應用價值，但因缺乏有效的早期肝癌檢測診斷的標志物而未能充分實施。現就血清標志物在HCC早期檢測中的研究進展及應用前景予以綜述，旨在為該領域的后續研究提供參考，切實提高HCC的早期診斷效率。

1 傳統血清標志物

甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)是一種高表達于胚胎發育時期參與多種物質轉運的糖蛋白，出生后AFP的表達快速降低(血清AFP水平低于10 ng/mL)，一般不能檢出。慢性肝炎、肝硬化和肝癌患者的血清AFP水平異常，尤其肝癌患者體內AFP水平持續升高，是目前唯一普遍應用于HCC臨床診斷的血清標志物。AFP對于HCC篩查的靈敏度和特異度很大程度上依賴其臨界值的設定，一般AFP水平高于400 ng/mL幾乎可確診HCC，但由于年齡、性別、肝癌早期血清AFP水平低(<200 ng/mL)等因素的影響，其檢出率較低(39%～65%)，容易漏診；若將診斷標準降至20 ng/mL則不能排除慢性肝炎等情況，導致特異性降低，誤診率較高[4]。相比單純檢測AFP，AFP聯合鱗狀細胞癌相關抗原或再合并鱗狀細胞癌相關抗原免疫復合物、AFP免疫復合物檢測肝癌的靈敏度分別提高至90.83%(特異度為44.44%)[5]或85%(特異度為81%)[6]。另外，參考我國香港等地區的經驗，AFP聯合超聲檢查也可顯著提高HCC的早期檢出效率[7]，而AFP聯合超聲檢查也是現今最普遍的HCC監測手段。Liu等[8]將經過肝炎指標校正的AFP，即AFP/(丙氨酸轉氨酶＊天冬氨酸轉氨酶)應用于人群樣本檢測，發現校正AFP對于HCC診斷的特異性和預測能力高于AFP，同時該指標與腫瘤大小、癌栓形成具有相關性。基于以上研究，AFP的檢測價值有限，需要新型生物標志物的代替或補充，幫助HCC高危人群篩查和早期診斷。

2 新型血清標志物

2.1AFP異質體 根據與扁豆凝集素親和力的不同，AFP可以分為三種異質體，即AFP-L1、AFP-L2和AFP-L3，其中AFP-L3與扁豆凝集素親和力很高。AFP-L3僅由肝癌細胞產生，但在肝炎等慢性肝病中無表達，因此，可以作為HCC的特異性標志物。AFP-L3的靈敏度不高，對于腫瘤直徑<2 cm肝癌的檢出率為35%～45%，對于肝癌的總檢出率僅有50%～60%，與傳統血清標志物AFP相比無顯著優勢，但其特異度高達95%以上[4]，能夠更好地區分肝癌與肝炎患者，適用于HCC高危人群的篩查和監測。研究人員通過檢測血清中AFP-L3含量占總AFP的比例(即AFP巖藻糖基化指數或AFP-L3%)，能夠在血清AFP水平較低(20～200 ng/mL)的肝炎或肝硬化人群中區分肝癌患者，可在HCC早期臨床診斷中減少漏診的發生[9]。同時，AFP-L3可以在一定程度上預測肝癌的惡性程度和復發、轉移情況[10]，因此，對于HCC患者的術前預后和隨訪調查也都具有重要意義。另外，檢測方法的不斷創新已將AFP-L3的最低檢出量降低至0.1 ng/mL，AFP-L3%水平在AFP水平低至3 ng/mL的樣本中仍可檢出(以前樣本AFP水平最少應達到10～20 ng/mL)[11]，并且檢測時間顯著縮短，更適于批量操作，便于臨床的推廣應用。總之，AFP-L3對HCC的特異性顯著優于AFP，可以作為補充以減少AFP在HCC早期診斷中誤診的發生。

2.2脫-γ-羧基-凝血酶原(des-γ-carboxy-prothrombin，DCP) DCP又稱人異常凝血酶原，是由維生素K缺乏或拮抗劑Ⅱ誘導產生的蛋白質。有研究者首次發現約90%的HCC患者的血清中含有DCP[12]，此后的試驗證據顯示HCC患者血清DCP水平升高顯著，而在肝炎肝硬化患者血清中只有輕度升高，血清DCP水平或可作為HCC篩查的有效標志物[13]。手術切除治療后，DCP水平降低并維持低水平者，HCC復發風險較低[14]；經肝臟移植的HCC患者中，移植前DCP水平低的患者HCC復發的比例低，患者存活率較高[15]；Orita等[16]發現，1例HCC患者術后出現肝內轉移時，DCP水平顯著升高而AFP水平正常，并且在發現股二頭肌轉移前7個月即能檢測到DCP水平異常升高，術后出現肺轉移時DCP水平亦顯著升高，這可能是由于DCP水平與微血管侵襲具有相關性，從而對HCC術后復發具有較高的預測價值。盡管DCP在肝癌中的表達特異程度高，但其血清水平與腫瘤大小呈正相關，因此，對于早期HCC和小肝癌患者，DCP的靈敏度不佳(腫瘤直徑<2 cm，靈敏度為18%～50%；直徑為2.1～3.0 cm，靈敏度為35%～60%)，不宜作為HCC早期篩查與診斷的獨立生物標志物，需要與其他標志物聯用以達到更好的檢測效果[17]。已有證據表明，DCP聯合AFP和(或)AFP-L3可將早期HCC檢測的靈敏度提高至91%[18]。DCP檢測現今已在日本、韓國、印度尼西亞等地開展臨床應用[19]，而我國尚未實施。目前，針對亞洲尤其是我國人群的DCP大規模、多中心的臨床研究正在進行，并且取得了一定進展[20]，結果令人期待。

2.3高爾基體糖蛋白73(Golgi protein-73，GP73) GP73是一種存在于高爾基體的Ⅱ型跨膜糖蛋白，通常認為，在正常肝臟中GP73主要表達于膽管上皮細胞，肝細胞無表達或僅少量表達，血清GP73水平低；而肝癌患者體內的肝細胞則可大量產生GP73(是肝臟正常狀態下的36～72倍)并進一步釋放到血清中，造成血清GP73水平顯著上調[4]。Marrero等[21]的研究顯示，在早期HCC的診斷方面，GP73的靈敏度為62%，遠高于AFP(靈敏度為25%)，表明GP73對于早期HCC的診斷效果優于AFP。綜合多項病例-對照研究的結果，GP73單獨診斷HCC的總體靈敏度為69%～83%，特異度為73%～97%[22]；若聯合AFP診斷，可將HCC檢出率從74.6%(特異度97.4%)提升至89.2%(特異度85.2%)[23]。研究發現，激活的肝星狀細胞也可以過度表達GP73[24]。同時，血清GP73水平與慢性乙型肝炎患者的肝臟纖維化病變程度具有相關性[25]。在一項針對我國人口的研究中發現，乙型肝炎病毒感染的肝癌患者血清GP73水平在所有檢測組中最高，血清GP73診斷乙型肝炎病毒相關性肝癌的靈敏度高達77.4%(特異度為83.9%)，顯著優于AFP(48.4%)[26]。我國乙型肝炎流行率較高，并且很大一部分肝癌患者是由肝炎轉化而來，因此，對于我國人口早期肝癌的診斷，GP73可能具有尤為重要的意義。但是與AFP、AFP-L3和DCP相比，GP73對于HCC術后復發的預測并無優勢，而DCP則與腫瘤侵襲能力顯著相關，在四者中預后價值最高[27]。作為一種重要的血清標志物，GP73能否應用于臨床還需要通過更大規模的隊列研究進行檢驗。

2.4骨橋蛋白(osteopontin，OPN) OPN是一種整合素結合磷酸化蛋白，在結腸癌、胰腺癌和乳腺癌等多種癌癥中表達均高于正常水平[28]。肝癌患者癌組織中的肝細胞和浸潤巨噬細胞能夠大量產生并釋放OPN，血清OPN水平顯著升高，并且與肝癌分期具有相關性，同時OPN的表達水平與肝癌肝內轉移和復發也具有相關性；更重要的是，肝癌患者血清OPN水平顯著高于肝炎或肝硬化患者，在乙型肝炎病毒感染的亞洲人群中，肝癌檢出率高于93%，表明OPN對肝炎和肝硬化等高危人群的篩查有重要意義[29]。中國、美國、泰國等人群的病例-對照研究結果均顯示，OPN對早期HCC的診斷效率顯著高于AFP，若兩者聯合檢測則診斷率可進一步提高[25-26]。一項涉及10個歐洲國家人群的大型隊列研究表明，OPN單獨或聯合AFP檢測對HCC的診斷效果優于AFP單獨檢測，且血清OPN水平越高，HCC患病風險越高[30]。而一項針對韓國人群的研究則發現，OPN診斷HCC的準確率低于AFP和DCP，認為OPN能替代傳統的標志物用于HCC的診斷[31]。因此，還需要進一步在不同地區人群中進行前瞻性研究以驗證OPN用于HCC早期診斷的可行性。

2.5磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3，GPC3) GPC3在健康成人、肝硬化和肝炎患者的肝組織或血清中均無明顯表達，但在HCC患者中顯著升高，并且升高水平與腫瘤大小和腫瘤分期無關，可能是一種潛在的肝癌特異性標志基因[32]。對腫瘤直徑<2 cm的小肝癌，GPC3檢測的靈敏度超過60%[31]。Capurro等[33]的研究結果顯示，GPC3單獨檢測HCC的靈敏度僅為53%(特異度為95%)，聯合AFP檢測靈敏度可以提高至82.4%。有研究結果顯示GPC3對于肝癌良好的特異性，特別是在AFP和DCP陰性的HCC患者中，應用GPC3檢測的陽性率可達30%～50%[34]。另外，在肝炎相關性肝癌的診斷方面，GPC3單獨檢測時靈敏度為38.5%(特異度為100%)，而與AFP、DCP聯合檢測時靈敏度高達80.8%，三者聯用對于肝炎相關性肝癌的診斷以及術后監測均具有潛在價值[35]。但一項薈萃分析的結果顯示，在肝硬化與肝癌的區別診斷方面，GPC3的特異度不如AFP(靈敏度相近)，兩者聯用效果更好[36]。

2.6Midkine(MDK) MDK是一種肝素結合蛋白，在健康成人的肝組織中不表達，在大多數腫瘤中高表達，參與腫瘤的發生、發展過程[37]。MDK是近年來通過基因芯片技術篩選出的具有潛在臨床應用價值的HCC早期診斷血清標志物之一[38]。一項涉及我國人群的多中心臨床研究表明，與AFP相比，MDK單獨進行HCC檢測具有較高的靈敏度(83.6%比51.9%)和相似的特異度(83.9%比86.3%)；對AFP陰性的HCC，其靈敏度高達89.2%，兩者聯合診斷可將檢測效率提升至94.9%；在早期HCC檢測中，MDK的表現也顯著優于AFP(80%比40%)；同時該研究還發現，肝癌患者術后血清MDK水平顯著降低，伴隨腫瘤的復發可再次升高，表明該標志物對術后的隨訪監測也有一定意義[39]。而我國的另一項前瞻性研究則發現，血清MDK水平的急劇升高大多發生在肝癌終末期患者中，認為MDK水平監測不適用于對HCC高危人群的篩查和術后緩解患者的隨訪監測[40]。因此，仍需要更進一步的探究。

2.7Dickkopf-1 (DKK1) DKK1是一種分泌蛋白，在包括肝癌在內的多種癌癥患者體內過表達。DKK1水平在HCC發病的早期即可升高，并在肝癌術后顯著降低[41]；高表達DKK1與不良預后有關[42]，提示血清DKK1水平對HCC的早期診斷和預后均具有重要意義。基于中國人群的多中心回顧性橫斷面研究發現，對于早期HCC患者，DKK1的靈敏度高于AFP，可以減少對AFP陰性HCC的漏診；同時具有更好的特異性，能夠區分大部分AFP假陽性的慢性肝炎肝硬化患者，因此，應用DKK1進行聯合檢測可以作為AFP的補充，提高檢測效率[43]。

2.8巖藻糖苷酶(α-L-fucosidase，AFU) AFU廣泛表達于哺乳動物細胞的溶酶體中，參與巖藻糖蛋白的代謝。Deugnier等[44]首次報道了HCC患者血清AFU水平增高，提出AFU為HCC診斷的潛在標志物。隨后Giardina等[45]發現，當閾值定為443 nmoL/(mL·h)時，其靈敏度和特異度分別為76%和90.9%；同時通過對肝硬化患者進行隨訪調查發現，約44%的肝硬化患者在超聲發現局灶性病變前6～9個月AFU水平即顯著增高。也有研究認為，AFU對早期HCC的診斷效率較低，與AFP相比并無優勢[46]。而與其他標志物(如AFP、胸苷激酶1)聯用則可提高診斷效率[47]。因此，需要進一步確認其診斷價值。

2.9甘露聚糖結合凝集素(mannose binding lectin，MBL) MBL由肝細胞合成，通過激活補體系統或介導巨噬細胞吞噬作用參與固有免疫調節，因此，MBL基因突變及其水平的改變可能導致對肝炎病毒的易感性增強，并促進肝炎向肝硬化、肝癌的進展[48]。Jalal等[49]的研究顯示，血清MBL水平可以作為預測慢性丙型肝炎病毒感染進展為HCC的標志物，而Segat等[50]則認為，MBL與肝炎相關HCC或其他因素誘導HCC的發生無關。因此，MBL對肝癌的指示作用還需要進一步探究。

2.10循環微RNA(microRNAs，miRNAs) 循環miRNAs是一類存在于血液、尿液等體液中或外泌體、微粒等膜囊泡中的小分子非編碼RNA。研究發現，乙型肝炎病毒或慢性乙型肝炎相關性HCC患者的血清中某些miRNAs水平出現異常，且miRNAs穩定性好、易于檢測，因此，也可以作為生物標志物應用于肝癌的診斷和監測[51]。研究者通過比較正常人、肝炎和肝癌患者血清miRNAs的組成和含量，篩選出一系列潛在標志物，如miR-21[52]、miR-122[53]、miR-223[54]、miR-224[55]、miR-26a[52]和miR-375[56]等，并指出這些miRNAs單獨或者聯合應用對HCC的早期診斷較傳統標志物更具應用前景。但直至目前，這些研究仍處于臨床前期研究階段，要應用到臨床還有諸多問題需要解決，如miRNAs種類眾多而每個樣本的檢測量有限，如何確定有效的miRNAs組合還需要更多的研究支持，如何能夠一次檢測更多的miRNAs還需要技術上的突破；選用不同類型的臨床樣本(血漿、血清、尿液)可能直接影響檢測結果，因此，在樣本的選擇上還需進一步探索；因缺乏各種miRNAs的標準參考值，檢測結果無法通過獨立的驗證加以證實等。

研究者們利用蛋白質組學技術篩選出了眾多新型潛在血清標志物[57]，如趨化因子配體15[58]、補體蛋白3a[59]、波形蛋白[60]、N-聚糖[61]、磷酸甘油酸激酶1[62]等，這些新型標志物仍處于臨床前試驗階段，其診斷價值有待進一步驗證。此外，AFP是目前唯一通過了5個階段測試的HCC生物標志物；DCP、AFP-L3、GP73和OPN正處于第3階段，被認為是目前最有潛力的新型血清標志物；其他新型標志物仍停留在第1～2階段(表1)。同時，應用蛋白質組學技術建立的診斷模型能夠在HCC的早期診斷中取得較好的效果，有研究者將蛋白質組學技術建立的診斷模型與標志物AFP聯用，結果HCC診斷的靈敏度提高至95%，同時特異度高達98%[63]。盡管如此，受技術等條件的制約，目前蛋白質組學技術還難以推廣使用。

3 小 結

每一種腫瘤標志物在診斷上都有其特定的優勢，但也存在局限性。就目前的結果看來，特別是對于HCC的早期檢測，單獨檢測任何一種生物標志物均未能達到理想的診斷目標，但應用不同標志物

表1 血清生物標志物的主要優勢作用及目前所處驗證階段

AFP：甲胎蛋白；DCP：脫-γ-羧基-凝血酶原；GP73：高爾基體糖蛋白73；OPN：骨橋蛋白；GPC3：磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3；MDK：Midkine；DKK1：Dickkopf-1；AFU：巖藻糖苷酶；MBL：甘露聚糖結合凝集素；miRNAs：微RNA；Proteomics：蛋白質組學；CCL15:趨化因子配體15；Vitronectin：玻連蛋白；HSP27：熱激蛋白27；Vimentin：波形蛋白；N-Glycan:N-聚糖；PGK1：磷酸甘油酸激酶1；第1階段：臨床前試驗；第2階段：病例-對照研究；第3階段：回顧性縱向研究；第4階段：前瞻性篩查研究；第5階段：隨機對照試驗

進行聯合檢測則能在提高肝癌檢出效率的同時減少漏診、誤診的發生。值得注意的是，并非聯合檢測的項目越多其診斷效果越好，且過度檢測也會增加不必要的經濟負擔。同時，對肝癌高危人群實施定期篩查，隨時間縱向評估各項標志物的動態變化，更有利于及時發現異常，提高診斷效率。因此，在不斷利用新技術挖掘更加靈敏和特異的標志物的同時，也應在已發現的標志物中探索適合各類HCC患者的聯合檢測策略，實現HCC的早期診斷。