miRNA、CEA及Monototal在非小細(xì)胞肺癌診斷中的價值

孫菲，王剛，張金仿

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院臨床檢驗中心，北京 100050)

肺癌在全球的發(fā)病率和死亡率極高，是嚴(yán)重威脅人類健康的主要腫瘤之一。目前，其已居于我國城市人口惡性腫瘤死亡的首位，且男性患病的比例大于女性，其中約80%為非小細(xì)胞肺癌[1]。由于非小細(xì)胞肺癌具有細(xì)胞分裂慢、擴(kuò)散轉(zhuǎn)移相對較晚、癥狀不典型、缺乏早期診斷依據(jù)等特點(diǎn)，約75%的非小細(xì)胞肺癌患者被發(fā)現(xiàn)時已處于癌癥中晚期[2]。微RNA(microRNA，miRNA)是一種長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，由內(nèi)源基因編碼。它與目標(biāo)信使RNA的3′非翻譯區(qū)部分或完全結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)。由于miRNA的靶標(biāo)識別是不完全配對的，故它具有調(diào)節(jié)多種基因表達(dá)的能力。miRNA參與多種生理過程，如個體發(fā)育、細(xì)胞分化、增殖、凋亡等[3]。有研究表明，大多數(shù)的miRNA基因位于與腫瘤形成相關(guān)的脆性基因位點(diǎn)上[4]，與癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其中miR-21、miR-146a在非小細(xì)胞肺癌患者血清中存在異常表達(dá)[5]。而血清腫瘤標(biāo)志物[癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、Monototal]檢測可以很好地避免細(xì)胞組織學(xué)檢測方法帶來的弊端，具有創(chuàng)傷小、檢測標(biāo)本來源方便、方法重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[6]，其在癌癥診斷、分類及預(yù)后等方面具有較好的臨床應(yīng)用價值[7]。研究發(fā)現(xiàn)，CEA、Monototal對非小細(xì)胞肺癌的治療及預(yù)后具有重要意義[8]。本研究旨在探討miR-21、miR-146a、CEA、Monototal在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其與非小細(xì)胞肺癌發(fā)病的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年10月至2018年 10月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院檢查確診并進(jìn)行手術(shù)治療的50例非小細(xì)胞肺癌患者作為研究對象，其中男32例、女18例，年齡32～71歲，平均(48.2±11.4)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合《NCCN非小細(xì)胞肺癌診斷指南》[9]的診斷標(biāo)準(zhǔn)，患者均未接受過化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)過化療、放療的非小細(xì)胞肺癌患者；②妊娠期婦女；③具有心腦血管疾病患者。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2方法 取所有患者手術(shù)切除癌組織標(biāo)本及距離癌組織5 cm以上的癌旁正常組織，使用4%中性甲醛水溶液對所采集的標(biāo)本進(jìn)行固定，并進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，隨后進(jìn)行連續(xù)切片作免疫組織化學(xué)標(biāo)記待用。

采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測miR-21及miR-146a的表達(dá)，所有操作過程嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒說明書進(jìn)行：將待測標(biāo)本和酶標(biāo)物與固相載體結(jié)合，其反應(yīng)的復(fù)合物經(jīng)過洗滌與其他物質(zhì)分離，加入酶反應(yīng)底物，反應(yīng)復(fù)合物經(jīng)過酶的催化作用形成有色物質(zhì)，根據(jù)顏色的深淺進(jìn)行定性或定量分析，從而判斷miR-21及miR-146a的表達(dá)水平。

提取待測標(biāo)本，按照酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒和Monototal試劑盒說明書對CEA、Monototal的水平進(jìn)行檢測。

2 結(jié) 果

2.1miR-21、miR-146a、CEA和Monototal在癌組織與癌旁組織中的表達(dá) miR-21、CEA和Monototal在癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，miR-146a在癌組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織(P<0.05)，見表1。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，癌組織中miR-21、CEA和Monototal的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，miR-146a的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織，見圖1。

組別miR-21miR-146aCEA(μg/L)Monototal(U/L)癌旁組織1.31±0.641.24±0.312.34±0.875.62±1.25癌組織 2.37±0.290.45±0.276.33±3.6454.68±11.59t值10.6728.6157.19429.761P值0.0030.0070.0020.001

miR：微RNA；CEA：癌胚抗原

2.2四項指標(biāo)與非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理資料的關(guān)系 不同性別、年齡非小細(xì)胞肺癌患者的miR-21、miR-146a、CEA和Monototal表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Ⅰ+Ⅱ 期、未及漿膜非小細(xì)胞肺癌患者的miR-21、CEA和Monototal表達(dá)水平低于Ⅲ+Ⅳ期、侵及漿膜非小細(xì)胞肺癌患者，miR-146a表達(dá)水平高于Ⅲ+Ⅳ期、侵及漿膜非小細(xì)胞肺癌患者(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤體積≥5 cm3、低分化、中分化非小細(xì)胞肺癌患者的miR-21、CEA和Monototal表達(dá)水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤體積<5 cm3、高分化非小細(xì)胞肺癌患者，miR-146a表達(dá)水平低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤體積<5 cm3、高分化非小細(xì)胞肺癌患者(P<0.05)，見表2。

2.3miR-21、miR-146a、CEA和Monototal表達(dá)的相關(guān)性分析 對miR-21、miR-146a、CEA與Monototal進(jìn)行相關(guān)性分析，miR-21在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)與CEA和Monototal的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.703，P=0.030；r=0.706，P=0.026)，與miR-146a的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.710，P=0.029)；miR-146a在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)與CEA和Monototal的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.753，P=0.011；r=-0.695，P=0.024)；CEA在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)與Monototal的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.709，P=0.016)。

miR：微RNA；CEA：癌胚抗原；a1：癌組織miR-21；a2：癌旁組織miR-21；b1：癌組織miR-146a；b2：癌旁組織miR-146a；

臨床資料例數(shù)miR-21數(shù)值t/F值P值miR-146a數(shù)值t/F值P值CEA(μg/L)數(shù)值t/F值P值Monototal(U/L)數(shù)值t/F值P值性別 男 女32182.35±0.272.36±0.310.7320.1090.46±0.230.44±0.150.5540.1786.31±2.636.22±2.590.4430.23153.16±11.6253.20±11.580.6400.206年齡 ≥60歲 <60歲28222.36±0.282.38±0.261.3410.1170.47±0.250.44±0.161.4460.3986.30±2.586.26±2.621.0130.27953.15±10.5853.19±10.601.3890.187分期 Ⅰ+Ⅱ期 Ⅲ+Ⅳ期33171.87±0.232.43±0.283.8450.0210.91±0.260.38±0.125.9670.0093.62±2.437.25±2.717.3410.01045.05±9.3157.37±10.639.8940.006淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有 無19312.52±0.311.98±0.263.2860.0020.35±0.110.83±0.338.9010.0138.03±2.813.01±1.326.6630.00558.23±12.7147.15±9.224.6610.015腫瘤體積 ≥5 cm3 <5 cm313372.63±0.262.01±0.222.9720.0050.27±0.080.62±0.264.3390.0117.96±2.772.85±1.547.3430.00458.15±12.6347.41±11.066.4570.007浸潤程度 未及漿膜 侵及漿膜29211.96±0.252.54±0.324.6460.0050.73±0.300.30±0.095.8400.0082.77±1.537.83±3.113.9730.01246.30±8.1157.33±12.726.3330.007分化程度 低分化 中分化 高分化723202.62±0.272.39±0.291.85±0.225.541a0.0350.18±0.040.43±0.190.96±0.227.123a0.0038.02±2.856.22±2.553.81±1.436.989a<0.00161.32±13.8555.22±11.6042.03±10.324.779a0.001

miR：微RNA；CEA：癌胚抗原；a為F值，余為t值

2.4miR-21、miR-146a、CEA及Monototal單獨(dú)檢測和聯(lián)合檢測非小細(xì)胞肺癌的診斷效能比較 根據(jù)免疫組織化學(xué)結(jié)果分類并計算后比較發(fā)現(xiàn)，CEA單獨(dú)檢測的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值顯著高于miR-21、miR-146a與Monototal單獨(dú)檢測；四項指標(biāo)聯(lián)合檢測的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值顯著高于四項指標(biāo)單獨(dú)檢測，見表3。

表3 miR-21、miR-146a、CEA及Monototal單獨(dú)檢測和聯(lián)合檢測的診斷效能比較

miR：微RNA；CEA：癌胚抗原

3 討 論

肺癌是目前最為常見的惡性腫瘤之一，其居于惡性腫瘤死亡率首位[10]。肺癌主要分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，其中非小細(xì)胞肺癌包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、大細(xì)胞癌等。與其他類型肺癌相比，非小細(xì)胞肺癌的癌細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移擴(kuò)散緩慢，所以前期不易被發(fā)現(xiàn)[11]。在臨床上，非小細(xì)胞肺癌患者常采用以放、化療為主的綜合治療模式[12]。

miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的單鏈非編碼RNA分子，其在機(jī)體內(nèi)參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)及調(diào)控的過程[13]。miRNA在機(jī)體生命過程中有重要作用，如參與機(jī)體的早期發(fā)育、細(xì)胞生長、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡及脂肪代謝，具有切斷靶基因及抑制靶基因翻譯的作用等[14]。目前只有少數(shù)miRNA的生物學(xué)功能被詳細(xì)闡明，miR-21及miR-146a作為較早發(fā)現(xiàn)的miRNA，它們在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中均存在異常表達(dá)[15]。本研究結(jié)果顯示，miR-21在癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，這可能是由于非小細(xì)胞肺癌患者癌細(xì)胞釋放過多的miR-21進(jìn)入了患者血液循環(huán)；而miR-146a在癌組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織，說明miR-146a能在一定程度上抑制非小細(xì)胞肺癌患者癌細(xì)胞的分化。吉叢等[16]研究表明，miRNA在癌癥的發(fā)生及進(jìn)展中均有重要作用，其中miR-21在胃癌、肝癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，故檢測miR-21在癌癥患者血清中的表達(dá)水平，對癌癥患者的診斷、治療及預(yù)后具有重要意義。

CEA是一種分布在細(xì)胞表面的糖蛋白，與腫瘤有關(guān)。它最初被發(fā)現(xiàn)于結(jié)腸癌和胎兒腸組織中，故命名癌胚抗原。成年人的CEA主要與胚層組織癌細(xì)胞有密切聯(lián)系[17]。CEA進(jìn)入血液或淋巴液，致使血清中的CEA水平升高，最終引起機(jī)體臟器中的細(xì)胞發(fā)生癌變，因此檢測CEA的血清水平對非小細(xì)胞肺癌的早期診斷具有重要意義[18]。最初人們將CEA作為結(jié)腸癌的早期特異性診斷指標(biāo)，后通過大量醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)表明，其在肺癌、胃癌、乳腺癌等其他癌癥患者血清中表達(dá)水平也較高[19-21]。周晶等[22]研究表明，CEA在非小細(xì)胞肺癌患者血清中的表達(dá)水平顯著高于正常人，本研究結(jié)果與上述研究一致。

Monototal作為一種新型的血清標(biāo)志物，近年來逐漸應(yīng)用于肺部良性疾病的臨床診斷，但關(guān)于其與非小細(xì)胞肺癌癥狀關(guān)系的研究較少[23]。本研究中，非小細(xì)胞肺癌癌組織中的Monototal表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，說明Monototal的表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌有密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，非小細(xì)胞肺癌中miR-21與CEA和Monototal的表達(dá)呈正相關(guān)，與miR-146a的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；CEA、 miR-21、miR-146a與Monototal聯(lián)合檢測的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值顯著高于四項指標(biāo)單獨(dú)檢測。這說明在非小細(xì)胞肺癌中，CEA、miR-21、miR-146a與Monototal的異常表達(dá)對其早期診斷有一定的臨床意義，尤其是四項指標(biāo)聯(lián)合檢測意義更大，對非小細(xì)胞肺癌的臨床治療具有較高的診斷價值。

綜上可知，在非小細(xì)胞肺癌中miR-21、miR-146a、CEA和Monototal的表達(dá)異常，且具有一定的相關(guān)性，同時四項指標(biāo)聯(lián)合檢測的診斷效能顯著優(yōu)于四項指標(biāo)單獨(dú)檢測，從而為非小細(xì)胞肺癌的臨床診斷提供理論依據(jù)。