男子30 km跑后尿液蛋白質(zhì)組差異性表達(dá)的研究

林文弢，藺海旗，楊 玲，徐國琴，翁錫全

尿液是血液經(jīng)腎小球?yàn)V過、腎小管和集合管重吸收、排泄及分泌產(chǎn)生的終末代謝產(chǎn)物，較血液等其他體液具有采樣簡便、無創(chuàng)傷、可重復(fù)取材的特點(diǎn)。自1878年VON.LEUBE[1]在士兵行軍時(shí)發(fā)現(xiàn)尿蛋白以來，國內(nèi)外在運(yùn)動性蛋白尿方面進(jìn)行了諸多研究[2-3]。在運(yùn)動訓(xùn)練中，尿蛋白不僅有量的改變且存在組份的差異[4-5]。受傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)分離與鑒定技術(shù)所限，現(xiàn)研究多局限于尿總蛋白、Alb、β2-MG 等幾個已知蛋白，難以對尿蛋白組進(jìn)行高通量、快速的并行研究及全面、系統(tǒng)地闡釋運(yùn)動對機(jī)體影響的分子機(jī)制和內(nèi)在規(guī)律。雙向凝膠電泳（2-DE）和質(zhì)譜（MS）技術(shù)的聯(lián)合使用與飛速發(fā)展給蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了很好的技術(shù)平臺。T.MARSHALL等[6]指出尿蛋白組學(xué)是采用蛋白組學(xué)技術(shù)與方法，系統(tǒng)的分析與鑒定尿液中蛋白質(zhì)分子，進(jìn)一步探究其生物學(xué)功能。目前尿蛋白組研究在正常人和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已取得一定成果，研究[7]顯示，正常人尿液中已鑒定出3280種蛋白質(zhì)，豐富了人類尿蛋白組數(shù)據(jù)庫。在體育科學(xué)領(lǐng)域，有關(guān)尿液蛋白質(zhì)組學(xué)的研究報(bào)道甚少，M.KOHLER 等[8]利用雙向凝膠電泳+質(zhì)譜（2-DE+MS）技術(shù)，研究不同項(xiàng)目（團(tuán)體、耐力、力量）運(yùn)動員運(yùn)動后尿液蛋白質(zhì)組份，發(fā)現(xiàn)不同運(yùn)動項(xiàng)目之間的尿蛋白組份和2-DE 圖譜表達(dá)存在差異。最近，研究團(tuán)隊(duì)[9-10]綜述了蛋白組學(xué)研究在體育科研領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展和未來前景。

鑒于此，本研究從蛋白質(zhì)組學(xué)整體的角度，探討30 km 跑對尿液蛋白質(zhì)組圖譜差異性表達(dá)的影響，篩選對評價(jià)運(yùn)動負(fù)荷和身體機(jī)能具有意義的目標(biāo)尿蛋白，分析其功能及特點(diǎn)，為運(yùn)動訓(xùn)練監(jiān)控尋找一種無創(chuàng)、系統(tǒng)化的評價(jià)方法提供試驗(yàn)借鑒和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)器材

微量移液器購自法國Gilson 公司、高速冷凍離心機(jī)（Beckman）、等電聚焦儀（GE ETTAN IPGPHOR3）、垂直電泳槽（GE ETTAN DALTsix）、ImageMaster 2D platinum 5.0（GE）、MALDITOF-TOF 質(zhì)譜儀（Bruker Dalton）。蛋白酶抑制劑PMSF、丙烯酰胺（Acylamide）、二硫蘇糖醇（DTT）購自Amresco 公司；IPG Buffer pH 4～7（GE）、胎牛血清標(biāo)準(zhǔn)品BSA、NH4HCO3購自Sigma公司；N，N，N’，N’-四甲基乙二胺、碘乙酰胺IAA購自Amersham公司；考馬斯亮藍(lán)G250購自Bio Basic公司；乙腈和十二烷基磺酸鈉分別購自Fisher和Promega。

1.2 尿液采集

以參加30 km挑戰(zhàn)賽10名男子為研究對象，身體健康且無泌尿系統(tǒng)疾病，具有一定長跑經(jīng)驗(yàn)，基本情況見表1。研究對象以賽事規(guī)定線路繞星湖綠道跑2圈，15 km/圈。氣溫19 ℃，濕度約50%，微風(fēng)。

表1 受試者基本情況（n=10）Table1 the Basic Information of the Subjects（n=10）

尿樣采集：（1）晨尿的采集：睡前排空尿液，晨起前不再排尿。無菌瓶收集晨尿，并記錄尿液容積以及睡前和晨起的采尿時(shí)間。隨后根據(jù)各自尿液容積將30～50 mL 尿液分裝于50 mL無菌Corning管，為避免蛋白酶解，每100 mL尿液加入1 mL PMSF（1 mmol/L），-80 ℃保存；（2）運(yùn)動后尿樣的采集：賽前排空，運(yùn)動后15 min收集尿液，其他操作同（1）。

1.3 蛋白提取

樣本復(fù)融后于4 ℃，6000 r/min，離心20 min，吸出上清，用孔徑0.45 和0.22 μm 的濾膜分別過濾一次，丙酮沉淀過夜。然后沉淀蛋白4 ℃，離心20 min，12000 r/min，傾去上清并干燥后得蛋白團(tuán)塊，于-80 ℃保存。用600 μL Tris飽和酚將沉淀團(tuán)塊充分裂解后，加入600 μL提取液。然后4 ℃，12000 r/min，離心20 min，吸出上層酚相，移到EP 管內(nèi)，重復(fù)操作一次。然后于-20 ℃以酚5倍體積的沉淀液沉淀蛋白過夜。沉淀蛋白4 ℃，12000 r/min，離心20 min，去上清；加1 mL 甲醇后吹打洗滌蛋白，12000 r/min，離心20 min，去上清；重復(fù)一次操作。晾干后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 雙向凝膠電泳

（1）固相等點(diǎn)聚焦：干燥后的蛋白質(zhì)經(jīng)再水化液（RB）溶解和Bradford 法定量后，加入上樣液（1% DTT、1% IPG Buffer、1×BPB、RB 至460 μL），上樣量120 μg。膠條經(jīng)泡脹過夜（10～12 h）后放入等電聚焦盤中。等電聚焦程序?yàn)椋?00 V 0.5 h、700 V 0.5 h、1500 V 1.5 h、9000 V 3 h、9000 V 5 h，總電壓為64 kVh。

（2）SDS-PAGE垂直電泳：將平衡后的膠條移至12.5%的凝膠上端，用0.8%低熔點(diǎn)瓊脂糖和1.5%的普通瓊脂糖封閉。雙向電泳：2 W/gel 45 min、17 W/gel 至溴酚藍(lán)到底，大約4.5 h。

1.5 凝膠染色與圖像分析

采用考馬斯亮藍(lán)G-250 染色法按照固定、漂洗、考染、漂洗的步驟進(jìn)行凝膠染色。采用UMAX Powerlook1100 凝聚圖像掃描儀對膠圖掃描，采用Image Master 2D platinum 5.0 對圖譜進(jìn)行背景消減、斑點(diǎn)檢測和蛋白匹配等分析，比較圖譜差異蛋白點(diǎn)。

1.6 質(zhì)譜分析

選取部分差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行胰蛋白酶膠內(nèi)酶切。利用MALDI-TOF-TOF（Autoflex speed?）質(zhì)譜分析。通過NCBI數(shù)據(jù)庫，查詢匹配蛋白，條件如下：物種來源：human；肽質(zhì)量：800～4000 Da；一級質(zhì)譜質(zhì)量誤差范圍：50 ppm；二級質(zhì)譜質(zhì)量誤差范圍：0.5 Da；表觀pI 與表觀Mr 的誤差范圍：無限制；酶解片段不完全：1 個；電荷：+1；固定修飾：Carbamidomethy；同位素峰：monoisotopic；可變修飾：Oxsidation；鑒定分值（Score）＞66（P＜0.05）。

2 結(jié) 果

2.1 雙向凝膠電泳（2-DE）圖譜特征

30 km 跑前、后尿液2-DE 電泳表達(dá)圖譜見圖1。如圖所示，從左至右pH 值為4～7 逐漸增加，從下往上分子量遞增，在10～130 kD 之間。從圖中呈現(xiàn)的蛋白質(zhì)分子量分布范圍看，蛋白質(zhì)分子量主要集中在20～80 kD 之間，大于80 kD 和小于20 kD 的蛋白質(zhì)分子很少，各點(diǎn)染色深淺和面積有一定差異，表明蛋白質(zhì)含量不同；從蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)來看，蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)多集中在4.5～6 之間，同時(shí)可見，左側(cè)斑點(diǎn)較多，右側(cè)斑點(diǎn)偏少，極堿性蛋白很少，說明尿液中酸性蛋白質(zhì)（圖譜左側(cè)）多于堿性蛋白質(zhì)（圖譜右側(cè)）。對運(yùn)動前、后2-DE 圖譜經(jīng)軟件分析和人工確認(rèn)比較，顯示運(yùn)動前、后尿液蛋白質(zhì)存在差異，主要表現(xiàn)在2-DE 圖譜斑點(diǎn)的增減、面積大小及染色的深淺上。

圖130 km運(yùn)動前（左）與運(yùn)動后（右）尿液蛋白質(zhì)2-DE圖譜Figure1 Representative 2-DE gel Images After Staining with Silver Nitrate for the Urine Sample from Athletes Before（Left）and After（Right）30 km Long-distance Running

2.2 雙向凝膠電泳（2-DE）圖譜差異性表達(dá)分析結(jié)果

對運(yùn)動前、后尿液蛋白質(zhì)2-DE 表達(dá)圖譜進(jìn)行分析，運(yùn)動前、后平均檢測到蛋白質(zhì)點(diǎn)（1011±243）和（1737±15）個。運(yùn)動前、后各重復(fù)電泳3 次，同時(shí)分別取一張膠為參考膠，其余膠與其匹配，匹配率分別為66.44%和73.02%，表明試驗(yàn)獲得了良好的重復(fù)性。

2-DE 圖譜經(jīng)軟件進(jìn)一步分析，30 km 運(yùn)動后與運(yùn)動前相比，共有110 個差異性表達(dá)蛋白點(diǎn)，其中運(yùn)動后表達(dá)量下調(diào)的點(diǎn)（含消失點(diǎn)）和表達(dá)量上調(diào)的點(diǎn)（含新增點(diǎn)）均為55 個，分別見圖2、3。

圖230 km運(yùn)動后表達(dá)下調(diào)點(diǎn)圖譜Figure2 Expression Downregulation Point 2-DE Maps of Urine Proteins from Athletes

圖330 km運(yùn)動后表達(dá)上調(diào)點(diǎn)圖譜Figure3 Expression Upregulation Point 2-DE Maps of Urine Proteins from Athletes

在運(yùn)動后差異表達(dá)量下調(diào)/上調(diào)的55 個點(diǎn)中，其具體數(shù)目及倍數(shù)分布情況見表2、3。

表230 km運(yùn)動后差異表達(dá)量下調(diào)/上調(diào)蛋白點(diǎn)數(shù)目及倍數(shù)分布Table2 the Number and Change Folds of Differentially Expressed Proteins After Exercise

表330 km運(yùn)動后差異表達(dá)≥5倍的蛋白點(diǎn)Table3 Information Related to the Proteins with Fold Change of ≥5

表430 km運(yùn)動后差異表達(dá)蛋白點(diǎn)質(zhì)譜鑒定結(jié)果一覽表Table4 Protein Expression Levels in the Urine Samples from Athletes After Running Identified by MALDI-TOF-TOF

2.3 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

選擇運(yùn)動后差異表達(dá)量上調(diào)≥5 倍和新增的蛋白點(diǎn)10 個，利用MALDI-TOF-TOF-MS質(zhì)譜儀對這些差異性蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行檢測，通過NCBI 數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定出6 個蛋白（見表4）。其中，B37、B18、B25、B26、B43 同為白蛋白；運(yùn)動前后6 個蛋白質(zhì)的蛋白點(diǎn)視圖（Spots view）見圖4。

圖430 km運(yùn)動前后6個差異表達(dá)蛋白點(diǎn)視圖Figure4 Differential 2-DE Analysis of Urine as Sampled Before and After the Race

3 討 論

機(jī)體運(yùn)動可引起內(nèi)環(huán)境、代謝產(chǎn)物以及營養(yǎng)狀態(tài)等發(fā)生改變，進(jìn)一步會影響有關(guān)基因的表達(dá)與蛋白的合成[11]，使運(yùn)動前、后蛋白組圖譜差異表達(dá)。本研究在對差異表達(dá)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)鑒定的基礎(chǔ)上，分析其功能發(fā)現(xiàn)這些蛋白與機(jī)體能量代謝方式的轉(zhuǎn)變、物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、應(yīng)激保護(hù)等有關(guān)。

3.130 km跑對尿液能量代謝相關(guān)蛋白的影響

鋅α2-糖蛋白（zinc α2-glycoprotein，ZAG）是血清中一種可溶性糖蛋白[12]。最近研究表明，其是一種新型脂質(zhì)動員因子，能促進(jìn)脂肪分解，降低體重[13-14]；同時(shí)，也是診斷前列腺癌等疾患的一種生物標(biāo)志物[15]。

目前，關(guān)于ZAG 和運(yùn)動之間的研究還比較少。研究發(fā)現(xiàn)[16-17]，運(yùn)動可使脂肪組織ZAGmRNA的表達(dá)水平上調(diào)，進(jìn)而減脂，降低體重，提示ZAG可能是一調(diào)節(jié)脂代謝的候選基因。本研究中，ZAG運(yùn)動后較運(yùn)動前表達(dá)量增加5.2倍，其含量的增加很可能與機(jī)體為了滿足30 km長時(shí)間耐力運(yùn)動時(shí)能量的需求，而引起ZAG 蛋白合成率增加，加強(qiáng)脂肪動員和促進(jìn)脂肪分解有關(guān)。研究表明，鋅α2-糖蛋白可引起脂動員，促進(jìn)BAT與肌肉組織表達(dá)解偶聯(lián)蛋白，增加機(jī)體能量消耗和脂質(zhì)利用[18]，這更進(jìn)一步支持該觀點(diǎn)。同時(shí)，M.KOHLER等[19]應(yīng)用2-DE+MS技術(shù)在馬拉松運(yùn)動后尿液中也檢測出ZAG，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。目前，ZAG與運(yùn)動尤其是脂肪細(xì)胞的功能相關(guān)研究文獻(xiàn)很少，有待深入研究。

3.230 km跑對尿液應(yīng)激保護(hù)相關(guān)蛋白的影響

維生素D 結(jié)合蛋白（vitamin D-binding protein，VDB）是一種多功能α-球蛋白，其包括白蛋白（ALB）、前白蛋白（PA）、甲胎蛋白（AFP）等，不僅具有攜帶維生素D 及血漿中的維生素D 的代謝物的功能[20]，同時(shí)還有促進(jìn)清除肌動蛋白、增加補(bǔ)體C5 對中性粒細(xì)胞的趨化活性、調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞活性、運(yùn)輸脂肪酸和內(nèi)毒素的功能[21-23]。

目前有關(guān)VDB 與運(yùn)動的研究甚少，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，受試者在30 km 運(yùn)動前，尿液中尚未發(fā)現(xiàn)VDB，而在運(yùn)動后作為新增點(diǎn)出現(xiàn)，這可能與長時(shí)間耐力運(yùn)動時(shí)，代謝產(chǎn)物大量堆積以及肌組織有一定程度的損傷和局部炎癥而致使肝臟細(xì)胞在這種運(yùn)動應(yīng)激條件下分泌VDB 增多，加強(qiáng)機(jī)體對代謝物的清除等功能，起到保護(hù)機(jī)體的作用有關(guān)，提示耐力運(yùn)動可能致使機(jī)體肌組織伴有一定程度的損傷及炎癥。目前，VDB 與運(yùn)動的作用關(guān)系及機(jī)制知之甚少，有待于從定量的角度進(jìn)一步更深入的研究與解析。

3.330 km跑對尿液細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的影響

肌動蛋白（Actin）是真核細(xì)胞中含量最豐富的蛋白質(zhì)之一，它是細(xì)胞的一種重要的骨架蛋白。Actin分為3種類型，即α、β、γ-Actin[24]。β-Actin分布廣泛，其是肌纖維及細(xì)胞骨架中具有收縮功能的一種主要蛋白成分。Actin 是構(gòu)成骨骼肌肌原纖維細(xì)絲的主要蛋白，參與肌肉的收縮，協(xié)助完成機(jī)體機(jī)械活動。

本研究顯示，30 km 長跑運(yùn)動后，較運(yùn)動前相比，運(yùn)動后尿液中出現(xiàn)新增蛋白點(diǎn)β-Actin。β-Actin的表達(dá)量上調(diào)，分析原因可能是隨著運(yùn)動時(shí)間的延長而引起骨骼肌細(xì)胞內(nèi)相關(guān)收縮蛋白的降解，這致使機(jī)體加強(qiáng)對收縮蛋白的合成來維持一定的運(yùn)動能力及正常功能，進(jìn)一步導(dǎo)致β-Actin 的表達(dá)量在血液中上調(diào)，而最終從尿液排出增多。同時(shí)，從肌損傷的角度來闡釋，這與上述VDB表達(dá)量變化的原因十分相似，二者共同反映的結(jié)果顯示，受試者在30 km 運(yùn)動后骨骼肌在很大程度上可能存在一定的細(xì)胞膜通透性增加或損傷，也許二者共同聯(lián)合探析運(yùn)動對機(jī)體骨骼肌效應(yīng)的化學(xué)本質(zhì)具有重要意義。現(xiàn)有文獻(xiàn)針對β-Actin與運(yùn)動的報(bào)道目前國內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)，有待于深入研究。

3.430 km跑對尿液轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)蛋白的影響

白蛋白（albumin，Alb）是血漿中最豐富的蛋白，健康成年人24 h尿蛋白總量約為10～100 mg，定性結(jié)果為陰性。研究顯示，尿Alb 含量可用于判斷腎小球?yàn)V過膜通透性的改變。同時(shí)，尿Alb可作為診斷腎小球相關(guān)疾病[25]。

本研究發(fā)現(xiàn)，30 km長跑運(yùn)動后，尿液中Alb 較運(yùn)動前作為新增點(diǎn)出現(xiàn)，這和前期定量測試尿Alb結(jié)果趨勢一致[26]，表明運(yùn)動Alb 顯著性增多，這可能與腎小球和（或）白蛋白膜的電荷改變有關(guān)。M.KOHLER 等[8，19]發(fā)現(xiàn)馬拉松運(yùn)動組較對照組比較，尿液蛋白質(zhì)圖譜中檢測出Alb 以及其碎片，認(rèn)為是由于運(yùn)動刺激機(jī)體所引起，但同時(shí)也不排除相應(yīng)機(jī)體患有腎小球腎炎疾病。在我們的研究中同樣也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果，并且Alb的殘基、碎片較多。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因，除M.KOHLER 的推測外，很大程度上應(yīng)該還與蛋白翻譯、修飾以及蛋白降解等多種情況致使同一個蛋白的不同修飾類型或者不同碎片出現(xiàn)在凝膠的不同位置，表現(xiàn)為多個蛋白點(diǎn)，鑒定結(jié)果類似有關(guān)。

3.530 km跑對尿液其它相關(guān)蛋白的影響

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，這里的其它蛋白是指與疾病有關(guān)的蛋白質(zhì)，包括2種：前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen，PSA）、本斯-瓊斯蛋白（bence-Jones protein，BJP）。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，這2 種蛋白分別與前列腺和骨髓瘤腎損傷等疾患有關(guān)，并有可能是各自對應(yīng)疾患的診斷標(biāo)志物。

PSA是由前列腺腺泡及前列腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞分泌的一種特異性糖蛋白。血清中PSA 的85%～90%與PMSF 結(jié)合，而10%～15%的PSA為游離狀態(tài)，游離的PSA在血清中的含量甚微且恒定[27]。PSA 因有靶器官的特性，目前被認(rèn)為是診斷前列腺癌的首選標(biāo)志物。研究報(bào)道，任何引起前列腺細(xì)胞破壞的病理過程（炎癥、尿潴留等）可致使血清PSA升高[28]。本研究顯示，尿液中PSA運(yùn)動后較運(yùn)動前作為新增蛋白點(diǎn)出現(xiàn)，表明運(yùn)動后尿液中PSA的濃度上升。究其因緣，可能與上述報(bào)道的長時(shí)間耐力運(yùn)動引起機(jī)體炎癥及尿潴留等因素破壞了前列腺細(xì)胞有關(guān)。上述因素可能進(jìn)一步破壞了前列腺腺泡，細(xì)胞外PSA被帶到血清中，使PAS含量升高，最終經(jīng)腎臟外排增多。

BJP是免疫球蛋白分子的輕鏈，Kappa或Lambda鏈[29]。BJP也可偶爾出現(xiàn)在正常人尿中，可表示腎功能損傷。骨髓瘤患者的腎小管細(xì)胞基膜或管腔內(nèi)均有蛋白沉淀，這意味著在生理?xiàng)l件下BJP 具不溶解性或分解代謝有缺陷。目前，BJP 在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域主要認(rèn)為其與骨髓瘤腎損傷有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動后尿液中出現(xiàn)SJP 的原因尚不明了，推測可能與長時(shí)間運(yùn)動造成腎小球/管暫時(shí)性損傷有關(guān)。

上述2 種疾病標(biāo)志物蛋白在運(yùn)動后出現(xiàn)，試驗(yàn)前，經(jīng)詢問，所有受試者均無相關(guān)疾病和病史，耐力運(yùn)動后尿液中這2 種蛋白濃度增加的具體機(jī)制尚不明確，有待深入探討；同時(shí)也反映出蛋白質(zhì)組學(xué)這一技術(shù)檢測蛋白質(zhì)組份具有很高的靈敏性。

4 結(jié)論與展望

（1）30 km跑引起尿液蛋白質(zhì)組表達(dá)顯著差異，表達(dá)上調(diào)/下調(diào)蛋白點(diǎn)各55個，目標(biāo)蛋白ZAG、VDB、β-Actin、Alb、PSA、BJP表達(dá)上調(diào)。

（2）ZAG的差異表達(dá)提示其可能為運(yùn)動營養(yǎng)補(bǔ)劑篩選的候選標(biāo)志；Alb可能與長時(shí)間耐力運(yùn)動應(yīng)激有關(guān)，用于運(yùn)動負(fù)荷評價(jià)；而VDB、β-Actin 的差異表達(dá)可能是肌組織損傷的標(biāo)志，PSA、BJP可能與腎小球/管暫時(shí)性損傷有關(guān)，4種差異蛋白可能作為診斷運(yùn)動性疲勞及肌損傷的潛在目標(biāo)蛋白。

（3）本研究是為構(gòu)建運(yùn)動員某一等級、運(yùn)動負(fù)荷及個體尿液2-DE蛋白圖譜的開端。尿液蛋白圖譜差異表達(dá)可用于監(jiān)測運(yùn)動性疲勞、預(yù)防肌損傷、運(yùn)動選材及機(jī)體病理性變化；同時(shí)，可作為運(yùn)動員血液生物護(hù)照的補(bǔ)充用于反興奮劑檢測，實(shí)現(xiàn)監(jiān)測無創(chuàng)化。