姜黃素和萬古霉素對大鼠腎小管上皮細胞乳酸脫氫酶釋放百分率及丙二醛的影響

羅潔，徐芬，丁嵐

（江西醫學高等專科學校檢驗教研室，江西 上饒33400）

萬古霉素自上市以來，已成為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的首選治療藥物[1]，但與此同時,中毒性腎損傷的副作用也日益成為臨床醫師在使用萬古霉素時有所顧慮的重要原因,從而限制其臨床應用[2]。近年來的研究表明，氧化應激機制為萬古霉素所致腎毒性的主要機制[3]。姜黃素（Curcumin）是提取自姜黃、郁金、莪術等植物塊莖中的一種天然活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗纖維化等多種藥理作用,其中抗氧化作用的主要機制被認為與清除自由基、增強抗氧化酶活性有關，因此被當作一種天然的抗氧劑[4]。目前尚無有關研究針對姜黃素是否對萬古霉素所致腎損傷具有保護作用進行探討。筆者就此進行了初步的研究，并對可能機制進行探討，現報告如下。

1 材料和方法

1.1 工作液配制 參考相關文獻報道[5]，本研究所涉及萬古霉素和姜黃素工作液濃度分別設定為30 μg/ml和25μmol/L。其中萬古霉素工作液的配制：將萬古霉素（美國Sigma公司）粉末用10ml 0.9%的生理鹽水溶解，配制成濃度為6 mg/ml的萬古霉素母液,再取1ml的萬古霉素母液,加入149ml的0.9%生理鹽水稀釋200倍配制成濃度為30 μg/ml的萬古霉素工作液。姜黃素工作液的配制：將姜黃素粉末(美國Sigma公司)25 mg溶于0.5 ml的二甲基亞砜（DMSO）中，待其完全溶解后加入無水乙醇至5 ml，配制成濃度為5 mg/ml的儲存液，再取276.30 μl的姜黃素母液，用滅菌三蒸水稀釋成150 ml的25 μmol/L姜黃素工作液。

1.2 細胞培養與分組 將健康的雄性SD大鼠（180～240g）麻醉后處死并于無菌操作下取其腎組織，去除包膜，分離并剪碎其腎皮質，過篩網得腎小管節段，0.25%胰蛋白酶消化,離心獲得單個腎小管上皮細胞,在37℃、5%CO2的細胞培養箱中用含10%胎牛血清的DMEM培養基進行常規培養2~3 d，之后再用0.25%胰蛋白酶消化傳代，倒置相差顯微鏡下觀察并證實處于對數生長期的腎小管上皮細胞,見圖1所示，將其按照4×105個/ml接種3 ml于培養瓶內,當達到80%的融合后棄培養基,經磷酸鹽緩沖液洗2次,再用無血清DMEM培養基同步靜止24 h后分別給予空白對照、姜黃素+萬古霉素、姜黃素和萬古霉素4種含不同藥物的工作液組，設定為空白對照組、姜黃素+萬古霉素試驗組、姜黃素試驗組和萬古霉素試驗組，各組均含3瓶細胞。

1.3 乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）釋放百分率測定 實驗4h后的各組細胞培養上清液轉移到另一96孔板，每孔加入20 μl的細胞裂解液，經37℃裂解45min后再各孔均加入180 μl的磷酸鹽緩沖液，充分混勻。將上清液與裂解液均3500 r/min 離心 10min， 每孔均取 50 μl樣品與 50 μl的LDH底物混合,室溫避光孵育30 min后加入終止反應液50 μl，經紫外可見分光光度計測定其490 nm處的吸光度（OD）值。LDH釋放百分率（%）=上清液LDH釋放量/（上清液LDH釋放量+裂解液LDH 釋放量）×100%[6]。

1.4 丙二醛（Malonaldehyde，MDA）含量測定 針對各組再設立不同的培養時間 （0 h、6 h、12 h、24 h、30 h、36 h、48 h） 對細胞培養上清液的 MDA 含量進行考察，嚴格按照MDA檢測試劑盒的說明書（南京建成科技有限公司）測定MDA含量。

1.5 統計學方法 采用SPSS 20.0統計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間計量資料比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

圖1 培養3d見大量腎小管上皮細胞生長

2 結果

2.1 LDH釋放百分率變化 細胞培養基中，LDH釋放百分率為萬古霉素試驗組>姜黃素+萬古霉素試驗組>姜黃素試驗組,差異均有統計學意義(P<0.05),與空白對照組相比，萬古霉素試驗組和姜黃素+萬古霉素試驗組的LDH釋放百分率均有增加（ΔLDH釋放百分率=試驗組LDH釋放百分率+空白對照組LDH釋放百分率>0）,且萬古霉素試驗組ΔLDH釋放百分率大于姜黃素+萬古霉素試驗組ΔLDH釋放百分率，見表1。

2.2 MDA含量變化 細胞培養上清液MDA含量在姜黃素+萬古霉素試驗組和萬古霉素試驗組中的含量均隨著時間延長而增高,而姜黃素試驗組和空白對照組中的MDA含量與0h相比無顯著變化（P>0.05），從24 h開始，在相同時間里，萬古霉素試驗組中的MDA含量增高與姜黃素+萬古霉素試驗組相比更顯著，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表2。

表1 細胞培養基中各組大鼠腎小管上皮細胞的LDH釋放百分率及其變化（x±s，n=3）

表2 各組細胞培養上清液中MDA含量（μmol/L）變化比較（x±s，n=3）

3 討論

本研究采用腎小管上皮細胞對外源性物質的腎臟毒性作用進行研究,通常可通過測定腎小管上皮細胞胞內酶LDH的釋放量并與空白對照組比較來反應腎小管內皮細胞損傷程度,其在細胞膜受損時可釋放到細胞外，當ΔLDH釋放百分率（試驗組LDH釋放百分率-空白對照組LDH釋放百分率）≤20%，表明存在細胞輕度損傷，當ΔLDH釋放百分率為20~50%時則為細胞中度損傷，而當ΔLDH釋放百分率≥50%時,則表明存在細胞重度損傷[7]。本研究結果表明,萬古霉素對大鼠腎小管上皮細胞可能具有腎毒性,而姜黃素對萬古霉素所致腎損傷具有改善作用,由表1可知，25 μmol/L的姜黃素可減少約 49.10%（即（8.37~4.26/8.37）×100%）的萬古霉素所致腎小管內皮細胞損傷程度。

有關萬古霉素所致腎毒性的具體機制目前尚不十分明確，動物研究表明，萬古霉素的腎毒性可能與其損害腎小球從而導致近端腎小管發生缺血壞死有關,其機制主要是萬古霉素導致近曲小管上皮細胞活性氧自由基的大量產生并隨后發生氧化應激反應所致[8,9]，另外有研究表明[10]，萬古霉素可導致近曲小管上皮細胞的氧耗量增加和線粒體功能改變以及腎組織中抗氧化酶（如過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等）基因表達下降。MDA作為細胞脂質過氧化反應的終產物,其含量多少可反映脂質過氧化的程度[11]，本研究進一步通過測定細胞MDA含量變化,對姜黃素改善萬古霉素所致腎損傷的可能機制進行探討，結果表明，隨著萬古霉素作用時間延長,大鼠腎小管上皮細胞的脂質過氧化程度越嚴重，而姜黃素可能具有抗氧化作用，其對該脂質過氧化程度具有緩解作用,其機制可能與姜黃素能夠抑制脂過氧化反應，維持過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等抗氧化酶的活性有關[12]。

綜上可知,本結果表明姜黃素對萬古霉素所致細胞腎損傷可能具有改善作用,并從氧化應激反應角度對其可能機制進行了探討。但本研究尚存在一定局限性，首先，有研究表明，姜黃素雖可保護生物膜免受氧化應激損傷,但高劑量的姜黃素有時卻表現為促氧化作用,使其效應能從抗氧化促氧化之間相互轉換[13,14]，因此本研究尚未進一步對不同劑量特別是高劑量姜黃素作用下,萬古霉素致腎小管上皮細胞的腎損傷程度變化進行探討。此外，本研究尚未對調控氧化應激上游的具體分子機制進行探討，袁嫣等[15]的研究表明，急性鈾染毒誘導了大鼠腎組織的氧化應激損傷并致急性腎毒性，而Nrf2通路損傷可能參與介導鈾誘導的大鼠急性腎毒性，因此，Nrf2通路損傷可能與萬古霉素所致腎毒性有關。而王道周等[16]的研究表明，姜黃素可能通過激活Nrf2/ARE信號通路，降低糖尿病腎病大鼠氧化應激、發揮腎臟保護作用。因此，關于Nrf2信號通路對氧化應激應答能力降低是否與萬古霉素所致腎毒性具有相關性,且姜黃素對萬古霉素所致腎損傷的保護作用是否與其參與Nrf2/ARE信號通路的激活作用有關,尚需進一步的研究證實。