TFF3、TPX2、WIP1、Ang2 表達(dá)水平變化與甲狀腺結(jié)節(jié)患病的關(guān)系

尹洪濤 ，古君 ，郭向陽(yáng) ，李英昭 ，陳秋

(1.信陽(yáng)市中心醫(yī)院，河南 信陽(yáng) 464000；2.信陽(yáng)市淮濱縣衛(wèi)生學(xué)校，河南 信陽(yáng) 464400；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

甲狀腺結(jié)節(jié)與甲狀腺乳頭狀癌的鑒別診斷對(duì)臨床上治療方案的確定及治療效果和預(yù)后具有重要作用[1]。目前較多的研究報(bào)道已經(jīng)明確VEGF、MMP-9等在甲狀腺乳頭狀癌組織中較高的染色陽(yáng)性率[2]。TFF3是呈三葉草結(jié)構(gòu)的小分子多肽，有研究報(bào)道其含量與乳腺癌、食管癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，較少的報(bào)道其與甲狀腺乳頭狀癌的關(guān)系[3]。TPX2是被證實(shí)的與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、凋亡、周期等密切相關(guān)的微管相關(guān)蛋白，可反映腫瘤的增殖能力、分化能力，凋亡失衡，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖分化[4]。WIP1是具有絲/蘇氨酸活性的磷酸蛋白酶[5]。有研究報(bào)道[6]其濃度與乳腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，很少報(bào)道其水平變化與不同類(lèi)型甲狀腺結(jié)節(jié)的相關(guān)性。本文檢測(cè) TFF3、TPX2、WIP1、Ang2 在不同類(lèi)型甲狀腺結(jié)節(jié)中的表達(dá)情況,并比較表達(dá)的陽(yáng)性率與腫瘤大小、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床特征的相關(guān)性。旨在為甲狀腺結(jié)節(jié)及甲狀腺乳頭狀癌的鑒別診斷提供科學(xué)依據(jù)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1.1 一般資料 隨機(jī)選取2016年1月－2017年1月我院甲狀腺手術(shù)切除標(biāo)本306例,經(jīng)病理證實(shí)分類(lèi)，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫56例、甲狀腺腺瘤95例、乳頭狀癌79例、濾泡癌41例、髓樣癌15例、未分化癌20例，患者中男性104例，女性202例，年齡為26歲～75歲，平均年齡為(45.56±9.12)歲；甲狀腺惡性腫瘤經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查，腫瘤直徑≥2.0cm者78例，腫瘤直徑＜2.0cm者77例，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者57例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者98例。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者臨床資料完整；術(shù)前未接受放化療；患者及家屬知情同意,均簽署知情同意書(shū)且經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有心、肝、腎等主要臟器功能不全；伴有其他部位惡性腫瘤者；妊娠期和哺乳期婦女；伴有免疫系統(tǒng)疾病。

1.2 檢測(cè)指標(biāo) 取術(shù)后切除的甲狀腺結(jié)節(jié)組織，大小約為0.5cm×0.5cm×0.5cm,常規(guī)制作石蠟切片，采用免疫組化 SP 法檢測(cè) TFF3、TPX2、WIP1、Ang2 蛋白表達(dá)。

1.3 檢測(cè)方法 采用石蠟進(jìn)行連續(xù)性切片，脫蠟至水后采用H2O2室溫下孵育10min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5min，8%的蛋白粉封閉液（商品名：BSA購(gòu)自南京博奧生物科技公司），封閉2h，倒去封閉液后加入一抗(兔來(lái)源 濃度1：1000～1500)，4℃冰箱過(guò)夜,磷酸鹽緩沖液沖洗3次,每次3～5min,加入二抗(鼠來(lái)源濃度 1：400～500),室溫孵育20～30min,磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5min，加入辣根酶或堿性磷酸酶的標(biāo)記物，室溫孵育10min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5min，滴加顯色劑（DAB購(gòu)自南京博奧生物科技公司），復(fù)染，脫水，封片。

1.4判定標(biāo)準(zhǔn) 以細(xì)胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色的顆粒為陽(yáng)性染色,綜合陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占瘤細(xì)胞比例和著色強(qiáng)度進(jìn)行半定量判定。 TFF3、TPX2、WIP1、Ang2 蛋白表達(dá)著色強(qiáng)度判定標(biāo)準(zhǔn)：不著色為0分；淺黃色為1分；黃棕色為2分；棕褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占瘤細(xì)胞比例判斷標(biāo)準(zhǔn)：選擇5～10個(gè)高倍視野,計(jì)算1000個(gè)腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞的百分率，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為0分；5%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。2種評(píng)分相加，最終結(jié)果 0～1 分為陰性(-)；2 分為陽(yáng)性(+)；3～4 分為強(qiáng)陽(yáng)性(++)；5～7 分為極強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件，各類(lèi)甲狀腺結(jié)節(jié)、不同直徑癌組織、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,癌組織間各蛋白表達(dá)強(qiáng)度比較采用Wileoxon秩和檢驗(yàn),組間各蛋白弱表達(dá)與強(qiáng)表達(dá)組織數(shù)量比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 甲狀腺結(jié)節(jié)組織TFF3蛋白表達(dá) 表1、表2結(jié)果顯示：在甲狀腺腫組織中，TFF3蛋白表達(dá)弱，在甲狀腺腺瘤組織中呈中等強(qiáng)度表達(dá),而在甲狀腺癌組織中陽(yáng)性至強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)80.65%，三組表達(dá)強(qiáng)度分布有顯著性差異（P<0.01）。在甲狀腺癌組織中，腫瘤直徑＞2cm組TFF3蛋白表達(dá)強(qiáng)于≤2cm組，發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移患者癌組織TFF3蛋白表達(dá)強(qiáng)于未發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移患者癌組織,差異均有顯著性（P<0.01）。

表1 各類(lèi)甲狀腺結(jié)節(jié)組織TFF3蛋白表達(dá)比較

表2 不同類(lèi)型甲狀腺癌組織TFF3蛋白表達(dá)比較

表3 各類(lèi)甲狀腺結(jié)節(jié)組織TPX2蛋白的表達(dá)比較

表4 不同類(lèi)型甲狀腺癌組織TPX2蛋白表達(dá)比較

表5 各類(lèi)甲狀腺結(jié)節(jié)組織WIP1蛋白的表達(dá)比較

2.2 甲狀腺結(jié)節(jié)組織TPX2蛋白表達(dá) 表3、表4結(jié)果顯示：不同性質(zhì)的甲狀腺結(jié)節(jié)組織TPX2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。臨床因素分析表明，TPX2蛋白表達(dá)與甲狀腺癌腫瘤大小及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有相關(guān)性（P<0.01）。

2.3 甲狀腺結(jié)節(jié)組織WIP1蛋白表達(dá) 表5、表6結(jié)果顯示：不同性質(zhì)的甲狀腺結(jié)節(jié)組織WIP1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。臨床因素分析表明，WIP1蛋白表達(dá)僅與甲狀腺癌腫瘤大小有關(guān)（P<0.01），而與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)關(guān)。

2.4 甲狀腺結(jié)節(jié)組織Ang2蛋白表達(dá) 表7、表8結(jié)果顯示：不同性質(zhì)的甲狀腺結(jié)節(jié)組織Ang2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。臨床因素分析表明，Ang2蛋白表達(dá)僅與甲狀腺癌腫瘤大小有關(guān)（P<0.01），而與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)關(guān)。

表6 不同類(lèi)型甲狀腺癌組織WIP1蛋白表達(dá)比較

表7 各類(lèi)甲狀腺結(jié)節(jié)組織Ang2蛋白的表達(dá)比較

表8 不同類(lèi)型甲狀腺癌組織Ang2蛋白表達(dá)比較

3 討論

目前，已經(jīng)有報(bào)道證明［7］MMP-9、VEGF 與腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲有密切聯(lián)系，并有報(bào)道證實(shí)[8]MMP－9、VEGF在甲狀腺乳頭狀癌組織中高表達(dá)。張寅等[9]通過(guò)免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn)甲狀腺乳頭狀癌患者組織中PCNA具有較高的染色陽(yáng)性率。研究能生物標(biāo)志物以鑒別診斷甲狀腺腫瘤的良性與否對(duì)治療方案的確定及預(yù)后至關(guān)重要。

TFF3是哺乳動(dòng)物TFF家族中三個(gè)成員之一，呈三葉草形態(tài)的小分子多肽。可抑制黏膜凋亡，具有黏膜保護(hù)和修復(fù)作用。促進(jìn)腫瘤擴(kuò)散。有報(bào)道證實(shí)其水平變化與乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[10]。 吳靖芳等報(bào)道［11］TFF3在甲狀腺乳頭狀癌患者與甲狀腺乳頭狀腺瘤中表達(dá)水平具有顯著差異。PTC組織中TFF3蛋白、mRNA陽(yáng)性表達(dá)率高于腺瘤、良性腫瘤伴增生。且其含量與腫瘤分期有關(guān)，董猛等［12］報(bào)道，III/IV期甲狀腺乳頭狀腫瘤患者TFF3表達(dá)水平高于I/II期患者,本研究結(jié)果顯示 TFF3、TPX2、WIP1、Ang2 蛋白在甲狀腺腫、甲狀腺瘤和甲狀腺癌三組間表達(dá)強(qiáng)度均有顯著差異（P<0.01）。TFF3、TPX2蛋白表達(dá)與腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.01）,與陳勇華等報(bào)道一致［13］。說(shuō)明，TFF3可作為甲狀腺結(jié)節(jié)與甲狀腺乳頭狀癌的鑒別診斷依據(jù)，且能評(píng)估臨床分期，細(xì)化診斷結(jié)果。TPX2是微管相關(guān)蛋白，在有絲分裂尤其是紡錘體形成過(guò)程中作用顯著。劉世強(qiáng)等報(bào)道［14］TPX2表達(dá)水平與胃癌、食管癌等表達(dá)密切相關(guān)。TPX2異常表達(dá)，可導(dǎo)致中心體異常擴(kuò)增，異倍體形成，細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化發(fā)生，促進(jìn)細(xì)胞增殖，與腫瘤細(xì)胞的周期、凋亡、分化、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)密切相關(guān)。本文顯示 TFF3、TPX2、WIP1、Ang2 蛋白在甲狀腺腫、甲狀腺瘤和甲狀腺癌三組間表達(dá)強(qiáng)度均有顯著差異（P<0.01）。提示，TPX2標(biāo)志甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的增殖能力,反映細(xì)胞分化和凋亡失衡狀態(tài),促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)現(xiàn)。TPX2可使腫瘤凋亡通路抑制，腫瘤細(xì)胞凋亡受阻。WIP1是具有絲/蘇氨酸活性的蛋白磷酸酶，有研究報(bào)道其與乳腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。Joe Y等［15］利用免疫組化法和PCR擴(kuò)增技術(shù)發(fā)現(xiàn),甲狀腺乳頭狀癌組織及正常甲狀腺組織高表達(dá)共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因chk2，其磷酸化組織腫瘤發(fā)生，甲狀腺乳頭狀癌組織中高表達(dá)的WIP1與chk2結(jié)合,去磷酸化,促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。本文顯示TFF3、TPX2、WI P1、Ang2蛋白在甲狀腺腫、甲狀腺瘤和甲狀腺癌三組間表達(dá)強(qiáng)度均有顯著差異（P<0.01）。提示，WIP1在甲狀腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、周期中起重要作用,在甲狀腺乳頭狀癌患者組織中高表達(dá)。腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)與新生血管的形成密不可分。新生血管的形成不僅為腫瘤的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng),并且新生血管壁薄弱，基底膜不完整，為腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移提供條件。Ang包含Ang1、Ang2、Ang3、Ang4四個(gè)成員,其中前兩種與新生血管的形成關(guān)系密切。Ang2作為一種分泌型糖蛋白,常以同源二聚體形式存在，是腫瘤誘導(dǎo)新生血管形成的早期標(biāo)志。本文顯示：TFF3、TPX2、WIP1、Ang2蛋白在甲狀腺腫、甲狀腺瘤和甲狀腺癌三組間表達(dá)強(qiáng)度均有顯著差異 （P＜0.01）。且WIP1、Ang2蛋白表達(dá)僅與腫瘤大小有關(guān) （P＜0.01），而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)（P＞0.05）。 說(shuō)明，Ang2表達(dá)水平在甲狀腺乳頭狀癌與甲狀腺結(jié)節(jié)患者表達(dá)差異顯著，前者顯著高于后者，可作為鑒別診斷的依據(jù)。

綜上所述 TFF3、TPX2、WIP1、Ang2 蛋白的免疫組化檢測(cè)有助于判別甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)。旨在為甲狀腺結(jié)節(jié)的臨床鑒別診斷提供科學(xué)依據(jù)。