脊髓損傷患者腸道菌群屬水平的特征及意義

汪俊宇，龐日朝，王文春，王美玉，向武，趙小華，張安仁

1.中國人民解放軍西部戰區總醫院康復醫學科，四川成都市 610083；2.四川大學生物治療國家重點實驗室，四川成都市 610041；3.西南財經大學天府學院，四川成都市 610052

腸道菌群數量與哺乳動物細胞之比約為10∶1，其基因組是人類基因組的1000倍[1-3]。這種巨大的微生物網絡對細胞的代謝、食物的消化、營養的吸收以及免疫系統調節都至關重要[4-6]。有益的非致病性腸道細菌被致病性細菌所取代，使腸道菌群原有的穩態被破壞，表現為腸道菌群失調。腸道菌群失調可對帕金森病、多發性硬化、阿爾茨海默病、孤獨癥、肌萎縮側索硬化等中樞神經系統(central nervous system,CNS)疾病的發生發展產生影響[7-11]。

動物實驗指出[12]，脊髓損傷后腸道菌群會發生紊亂，嚴重降低脊髓損傷后的運動功能。小樣本臨床報道脊髓損傷患者腸道菌群變化特征，并發現5個菌屬具有統計學意義[13]。國內張潔等[14]發現，急性創傷性脊髓損傷患者存在腸道菌群紊亂，且菌群變化與血清生化標志物的升高相關。脊髓損傷后腸道菌群紊亂可能與病情的發展以及后期的康復結局關系密切，值得深入研究。

本研究分析脊髓損傷患者腸道菌群屬水平的變化特征，探討其在臨床康復中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2018年1月至12月，選取本院脊髓損傷住院患者23例(患者組)，同期體檢健康受試者21例(對照組)。

診斷標準：美國脊髓損傷協會(American SpinalⅠnjury Association,ASⅠA)制定的脊髓損傷神經學分類國際標準(2013修訂)[15-16]。

納入標準：①18～60歲；②近1個月內未使用抗生素、益生菌、益生元、合生元等制劑；③無心、肝、腎和造血系統等嚴重原發性疾病；④無嚴重腹瀉、炎癥性腸病等胃腸道疾病以及半年內未進行糞菌移植治療；⑤無呼吸衰竭、心力衰竭、腎衰、肝衰、嚴重的肺感染，膀胱感染以及癌癥等對患者生活質量有嚴重影響的疾??；⑥受試者本人或直系親屬知曉，并簽署知情同意書。

排除標準：①妊娠期、哺乳期婦女；②不能夠配合完成本研究。

脊髓損傷患者的一般資料見表1。納入研究的脊髓損傷患者血液白細胞數都在正常參考范圍內；絕大多數患者尿液中的白細胞數、細菌數都在正常范圍內，無嚴重的膀胱感染現象發生，研究階段均未使用抗生素治療。

對照組中男性16例，女性5例，平均年齡(37.05±7.871)歲；患者組中男性18例，女性5例，平均年齡(35.87±8.275)歲，神經源性腸道功能障礙(neurogenic bowel dysfunction,NBD)評分(12.57±6.298)分。兩組在性別、年齡方面無顯著性差異(P＞0.05)。見表2。

本研究得到中國人民解放軍西部戰區總醫院倫理委員會批準(No.2018ky08)，并在中國臨床試驗中心注冊(No.ChiCTR1800016823)。

1.2 方法

準備好一次性糞便容器，消毒洗手，戴一次性醫用塑料手套，每個糞便收集管收集0.5～1 g樣品，分裝后立即蓋上管蓋，盡可能使樣品處于相對厭氧環境。注意樣品不能反復凍融。

腸道菌群檢測及生物信息學分析測序步驟如下。①樣品編號后立即轉入-80 ℃的冰箱中保存。

②根據PowerFecal?DNA Ⅰsolation Kit試劑盒(德國QⅠAGEN公司)說明書進行糞便樣品總DNA提取。

③引物合成：合成帶有Barcode的特異引物16S。引物使用515F(5'-GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3') 和 806R(5'-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3')[17-18]。

④對樣本的16S rDNA V4區域進行擴增：以稀釋后的基因組DNA為模板，根據測序區域的選擇，使用帶Barcode的特異引物進行聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)。每一個25 μl的體系包括1×PCR buffer、1.5 mmol/L MgCl2、0.4 μmol/L dNTPs、正向和反向引物各1.0 μmol/L、0.5 U KOD-Plus-Neo酶(TOYOBO)和10 ng模板。PCR程序包括起始94 ℃1 min，然后30循環(變性94 ℃20 s，退火54 ℃30 s和延伸72 ℃30 s)，最后72 ℃5 min。每個樣本進行3個重復，每個PCR反應終止于線性擴增期，PCR結束后將同一樣本的PCR產物混合后進行電泳檢測，使用膠回收試劑盒切膠回收PCR產物，TE緩沖液洗脫回收目標DNA片段。

⑤HiSeq文庫構建及測序：使用PowerFecal?DNA提取試劑盒對PCR擴增產物(每個樣本3 μg)進行測序前準備，具體操作參照試劑盒說明。使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit試劑盒建庫，然后在Ⅰllumina Hiseq測序儀平臺對PCR產物進行雙端測序。

⑥生物信息學分析：首先對兩組屬水平上的組成進行分析，然后通過隨機森林機器學習的方法對兩組糞便樣品中的腸道菌群進行比較分析。

表1 脊髓損傷患者情況

表2 兩組一般資料比較

1.3 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行分析。計量資料先做正態性檢驗及方差齊性檢驗，若符合正態分布且滿足方差齊性，以()表示，運用t檢驗；若不符合上述條件，則以M(Ql,Qu)表示，運用非參數檢驗(Mann-WhitneyU)。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 物種組成分析

由于屬水平的物種數量較多，本部分只展示相對豐度較高的菌屬。

對照組占主要地位的菌屬除了Alistipes (理研菌屬)、Parabacteroides (紫單胞菌屬)、Megasphaera (氨基酸球菌屬)、Prevotella 9 (普雷沃氏菌屬9)、Escherichia-Shigella (埃希氏菌屬-志賀氏菌屬)、Lachnospiraceae UCG-008 (毛螺旋菌屬UCG-008)、Ruminococcaceae UCG-014(瘤胃菌科UCG-014)、[Ruminococcus]torques group (瘤胃球菌屬-torques group)、Enterobacter(腸桿菌屬)、Roseburia(羅斯氏菌屬)、Lachnospiraceae UCG-004 (毛螺旋菌屬UCG-004)、Prevotella 2(普雷沃氏菌屬2)、Fusobacterium (梭桿菌屬)的平均相對豐度低于1%以外，Bacteroides (擬桿菌屬)、Megamonas (氨基酸球菌屬)、[Eubacterium]coprostan oligenes group、Ruminococcaceae UCG-002(瘤胃菌科UCG-002)、Lachnospiraceae NC2004 group (毛螺旋菌屬NC2004 group)、Lachnospiraceae NK4A136 group (毛螺旋菌屬NK4A136 group)、[Eubacterium]eligens group(優桿菌科)、Phascolarctobacterium (光岡菌屬)等8個菌屬的平均相對豐度都大于1%。

患者組除Megamonas(氨基酸球菌屬)、Prevotella 9 (普雷沃氏菌屬9)、[Eubacterium]eligens group(優桿菌科)、Ruminococcaceae UCG-014(瘤胃菌科UCG-014)、Enterobacter (腸桿菌屬)、Roseburia (羅斯氏菌屬)、Lachnospiraceae UCG-004 (毛螺旋菌屬UCG-004)、Prevotella 2(普雷沃氏菌屬2)、Fusobacterium(梭桿菌屬)等菌屬的平均相對豐度低于1%外，其余菌屬的相對豐度均高于1%。見表3。

與對照組相比，患者組Escherichia-Shigella(埃希氏菌屬-志賀氏菌屬)、Lachnospiraceae UCG-008(毛螺旋菌屬UCG-008)、Alistipes(理研菌屬)、Parabacteroides(紫單胞菌屬)、[Ruminococcus]torques group(瘤胃球菌屬-torques group)等菌屬相對豐度增高(P＜0.05)，而Fusobacterium (梭桿菌屬)的平均相對豐度降低(P＜0.05)。見表3。兩組間的某一些菌科差異比較明顯，并且在每個樣品中個體差異也比較明顯。

2.2 物種差異分析

本研究分析Gini指數＞0.2的菌群，發現兩組在各個分類水平都存在顯著性差異(P＜0.05)。在屬水平，與對照組比較，患者組中豐度升高的重要標志性菌屬分別是：瘤胃菌科的UBA1819、Ruminiclostridium 9、Ruminococcaceae NK4A214 group、Ruminococcus 2、Ruminococcaceae UCG-005、Ruminiclostridium 5、Flavonifractor；理研菌科的Alistipes、dgA-11 gut group、Rikenellaceae RC9 gut group；毛螺菌科[Eubacterium]oxidoreducens group；消化鏈球菌科的Ⅰntestinibacter；腸桿菌科Escherichia-Shigella (志賀菌屬)；以及Tannerellaceae的Parabacteroides (P＜0.05)?；颊呓M豐度顯著降低的是梭桿菌科的Fusobacterium菌屬(P＜0.05)。見圖1和表4。

3 討論

脊髓損傷后由于自主神經功能受到損害，導致患者對感染的易感性增加，免疫功能降低，心血管功能障礙甚至出現其他代謝性疾病；抑郁、焦慮等心理問題也隨之出現。此外，脊髓損傷患者由于CNS受損，經常出現NBD，表現出便秘或大便失禁等癥狀。本組患者NBD評分結果顯示不同程度的NBD。

本研究顯示，屬于Ruminococcaceae (瘤胃菌科)的UBA1819、Ruminiclostridium 9、Ruminococcaceae NK4A214 group、Ruminococcus 2、Ruminococcaceae UCG-005、Ruminiclostridium 5、Flavonifractor豐度為增加。推測可能與脊髓損傷患者長期處于抑郁狀態相關。有研究發現[19]，脊髓損傷患者抑郁的發生率較高。近年來，諸多研究證實腸道菌群與抑郁癥的發生發展密切相關，其中瘤胃菌科與抑郁存在緊密聯系[20-21]。也有研究表明[22]，瘤胃球菌與CNS疾病關系密切，瘤胃球菌與神經健康的標志物N-乙酰天門冬氨酸(N-acetylaspartate,NAA)、血清5-羥色胺和皮質醇呈負相關，腸道瘤胃球菌可通過血液中的皮質醇間接影響大腦NAA。

表3 兩組在主要屬水平上的菌群相對豐度(%)

圖1 兩組屬水平上的菌群差異分析

表4 兩組屬水平上的菌群差異統計表

同時，我們發現Rikenellaceae (理研菌科)的Alistipes、dgA-11 gut group、Rikenellaceae RC9 gut group等菌屬是脊髓損傷組重要的標志性細菌，其中Alistipes重要性最大。Zhao等[23]的研究發現，Alistipes菌屬相對豐度上升與結腸內長鏈飽和脂肪酸(saturated long-chain fatty acid,SLCFAs)含量增加呈正相關，SLCFAs對結腸運動具有刺激作用，SLCFAs增加可直接引起結腸運動增強，從而提高排便的頻率，導致正常宿主腸功能紊亂癥狀的發生。雖然Alistipes菌屬促進結腸運動的具體機制尚不明確，是否需要完整的中樞神經參與也不太清楚，但進一步研究該菌屬對結腸的作用或許對促進脊髓損傷后的胃腸蠕動有重要的意義。

我們還發現患者組中某些腸道致病菌相對豐度增加，如屬于Peptostreptococcaceae (消化鏈球菌科)的Ⅰntestinibacter (腸桿菌)相對豐度增加，該病原菌可引起人體組織和器官感染，如肺部、胸膜感染，顱內感染及軟組織感染等。屬于Enterobacteriaceae (腸桿菌科)的Escherichia-Shigella (志賀菌屬)相對豐度增多。志賀菌屬是腸道中的一類致病菌，可以引起急性直腸、結腸炎，臨床癥狀表現為水樣瀉、黏液膿血便、里急后重，部分患者有劇烈頭痛[24]。在脊髓損傷患者臨床康復期間的腸道管理中，我們應該密切關注志賀菌屬與消化鏈球菌屬，積極預防各種感染以及痢疾、腹瀉等腸道疾病。

此外，本研究還發現，與對照組比較，患者組產生丁酸代謝產物的梭桿菌屬(Fusobacterium)顯著減少。丁酸對人體健康有著積極的促進作用，具有抗炎、抗癌、增強結腸的防御功能、促進營養物質吸收等作用[25-29]。今后還要進一步研究其對丁酸含量的影響。

本研究初步分析了中國脊髓損傷患者腸道菌群屬水平的特征。不足之處在于樣本量較小。未來將根據不同病程、損傷程度、損傷平面對脊髓損傷患者進行亞分組分析，以更全面、充分地闡釋脊髓損傷患者腸道菌群的變化特點。雖然本次研究發現某些與脊髓損傷患者臨床康復關系密切的腸道菌屬，但還需要通過基礎研究來進一步尋求證據。密切關注脊髓損傷后的腸道菌群變化，對提高脊髓損傷患者免疫功能、生活質量，減少并發癥，促進全面康復，或許有一定的臨床價值。