靈芝三萜對癲癇大鼠學習記憶損傷的效果

農雪娟，金佳熹，周冰玉，張麗鳳，洪劍威，趙爽

1.右江民族醫學院附屬醫院檢驗科，廣西百色市 533000；2.右江民族醫學院，a臨床醫學院；b.基礎醫學院，廣西百色市 533000

目前全球約有7000萬癲癇患者，90%生活在發展中國家[1]，近一半患者存在認知功能特別是學習記憶功能障礙，嚴重影響癲癇患者的生活質量[2]。如何改善癲癇后學習記憶等認知受損已成為當前腦科學研究熱點之一。既往研究證實，靈芝孢子主要成分靈芝三萜具有抗氧化、提高免疫力、抑制神經細胞凋亡等作用，同時具有一定程度的抗癲癇作用[3-5]。靈芝的主要化學和藥效成分為三萜類靈芝酸。外源性單唾液酸四己糖神經節苷脂(monosialoteterahexosyl ganglioside,GM1)對神經受損修復、再生有重大促進作用[6-8]。本研究利用靈芝三萜聯合GM1對戊四氮致癇腦損傷后與突觸生長重塑密切相關的肌動蛋白結合蛋白(actinbinding protein,Cofilin)、突觸素(synaptophysin,SYN)、神經生長相關蛋白43 (growth-associated protein 43,GAP-43)等基因表達進行實驗研究，從而進一步探討癲癇的發病機制和靈芝藥效成分的抗癇機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠75只，體質量(200±20) g，購自長沙市天勤生物技術有限公司[SCXK(湘)2014-0011]。動物飼養在右江民族醫學院實驗動物中心[SYXK(桂)2017-0004]，對實驗動物的操作處理符合醫學倫理學標準和動物3R原則，均已經過右江民族醫學院倫理委員會批準。所有動物按自然晝夜，普通環境飼養，室溫(25±1)℃，自由飲食。

1.2 主要試劑與儀器

戊四氮：美國SⅠGMA公司。GM1注射液：齊魯制藥有限公司。靈芝三萜化合物(三萜含量249 g/kg)：廣州白云山漢方現代藥業有限公司。AxyPrep總RNA小量制備試劑盒：美國AXYGEN公司。RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit：賽默飛科技有限公司。FastStart Universal SYBR Green Master：瑞士羅氏公司。Cofilin、SYN、GAP-43 mRNA PCR引物合成：生工生物工程(上海)股份有限公司。ABⅠ7500實時熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)儀：美國ABⅠ公司。HT7700透射電子顯微鏡：日本HⅠTACHⅠ公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及處理

將實驗動物分為空白對照組、癲癇模型組、靈芝三萜組、GM1組和靈芝三萜聯合GM1組，共5組，每組15只。

除空白對照組外，其余各組腹腔注射亞驚厥劑量戊四氮35 mg/kg，每天1次，持續28 d，復制慢性癲癇模型。空白對照組以等容生理鹽水腹腔注射。

同時，癲癇模型組灌胃同體積生理鹽水；靈芝三萜組每天灌胃靈芝三萜1000 mg/kg；GM1組腹腔注射GM130mg/kg；靈芝三萜聯合GM1組灌胃靈芝三萜1000 mg/kg，腹腔注射GM1 30 mg/kg。空白對照組灌胃同體積生理鹽水。灌胃前禁食6 h。

大鼠癲癇發作評分標準按Ono法[9]：0級，行為上無任何形式的發作反應；Ⅰ級，節律性點頭或面部抽動；Ⅱ級，陣攣性咀嚼或點頭甩尾；Ⅲ級，頭部顫搐加前肢陣攣性抽搐；Ⅳ級：呈袋鼠姿勢或多肢抽動；Ⅴ級，身體失去平衡，甚至傾倒；Ⅵ級，全面持續強直-陣攣發作。注射后每天觀察大鼠30～60 min，記錄癲癇發作的級別，出現連續5次≥Ⅱ級驚厥發作即為造模成功。

1.3.2 檢測方法

1.3.2.1 Morris水迷宮測試

定位航行實驗：造模成功后次日每組隨機抽取10只大鼠進行定位航行實驗，歷時5 d。第1天讓大鼠自由游泳1 min后開始訓練，每天同一時段訓練4次，訓練時隨機選擇入水點，將大鼠面向池壁放入水中，觀察記錄大鼠每次自入水至尋找到并爬上平臺所需時間，即逃避潛伏期(s)。4次訓練分別從4個不同入水點入水，如果大鼠在60 s內未找到平臺，潛伏期記為60 s，每次訓練間隔60 s。

空間探索實驗：第6天進行，用于測量大鼠對平臺空間位置的記憶能力。撤走平臺，將大鼠面向池壁任選一個入水點入水，測試大鼠在60 s內跨過原平臺所在位置的次數，同時記錄在目標象限停留時間。

1.3.2.2 海馬神經元病理組織學檢查

行為學實驗完成后，10%水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，冰上快速斷頭取腦，各組隨機選取5只大鼠腦組織，4%多聚甲醛固定24 h，95%～75%梯度乙醇脫水，常規石蠟包埋，4μm連續切片，常規蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色，光學顯微鏡下觀察各組腦海馬CA1區錐體細胞數目及形態結構改變。

1.3.2.3 透射電鏡觀察神經元超微結構

各組再隨機取3只大鼠腦組織，分離海馬組織，立即放入2.5%戊二醛緩沖液中，參照腦立體定位圖譜將CA1區海馬組織切成數個1×1×1 mm小塊，再放入2.5%戊二醛緩沖液，4 ℃冰箱固定2～4 h，常規包埋，超薄切片，經鈾鉛雙染色(2%醋酸鈾飽和酒精溶液、枸櫞酸鉛，各染色15 min)，透射電子顯微鏡下觀察神經元超微結構。

1.3.2.4 實時定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)

各組其余的7只大鼠斷頭取腦，于冰上用冰生理鹽水漂洗大腦血漬，再用濾紙拭干后取出海馬組織，立即裝入冷凍管中，并將凍存管迅速放入液氮中保存。按AxyPrep總RNA小量制備試劑盒說明提取總RNA，按RNA PCR試劑盒說明進行qPCR反應，GADPH作內參，檢測海馬Cofilin、SYN和GAP-43的mRNA表達水平。qPCR引物序列見表1。

表1 目的基因與內參照引物序列

反應結束后，數據處理采用2-△△CT法(Livak法)進行分析處理，再根據所得的數據計算出海馬Cofilin、SYN和GAP-43的mRNA相對表達量。

1.4 統計學分析

采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，所有計量資料均經過正態性檢驗，符合正態分布，以()表示。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較采用LSD檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 Morris水迷宮測試

定位航行實驗顯示，各組逃避潛伏期隨時間有不斷縮短趨勢。與空白對照組比較，各時間點癲癇模型組逃避潛伏期延長(P＜0.05)；與癲癇模型組比較，各用藥組逃避潛伏期均縮短，部分時間點有顯著性差異(P＜0.05)。見表2。

空間探索實驗顯示，與空白對照組比較，癲癇模型組穿越平臺次數明顯減少(P＜0.01)，在目標象限停留時間明顯縮短(P＜0.01)；與癲癇模型組比較，各用藥組穿越平臺次數均明顯增多(P＜0.01)，在目標象限停留時間明顯延長(P＜0.01)。見表3。

2.2 海馬神經元病理組織學

空白對照組海馬CA1區神經元細胞形態正常，整齊排列，胞質豐富，細胞核大而圓；癲癇模型組海馬神經元細胞較少，排列疏松、紊亂，胞質深染，胞核溶解碎裂，呈空泡狀；各用藥組海馬神經元細胞較模型組有所改善，神經元細胞數量增多，細胞形態趨于正常，排列比較整齊，胞核碎裂固縮減少。見圖1。

2.3 海馬組織透射電鏡觀察

空白對照組海馬CA1區神經元細胞核膜結構清楚，形狀規則，突觸結構、數量及突觸前后囊泡正常，線粒體等細胞器形態正常；癲癇模型組神經元細胞核膜結構不清楚，形狀不規則，突觸小泡數量變少，突觸數量減少，線粒體嵴斷裂，部分嵴消失，細胞器腫脹變形；各用藥組神經元細胞核膜結構較清楚，突觸結構較完整，突觸小泡數量增多，突觸數量增加，線粒體等細胞器結構有所改善。見圖2。

2.4 海馬Cofilin、SYN、GAP-43 mRNA表達

與空白對照組相比，癲癇模型組Cofilin mRNA水平上調(P＜0.05)，SYN mRNA和GAP-43 mRNA水平降低(P＜0.05)；與癲癇模型組比較，各用藥組Cofilin mRNA表達水平降低(P＜0.05)，SYN mRNA表達水平升高(P＜0.05)，僅靈芝三萜聯合GM1組GAP-43 mRNA升高(P＜0.05)。見表4。

表2 各組定位導航實驗平均逃避潛伏期(s)

表3 各組目標象限停留時間及穿越平臺次數比較

圖1 大鼠海馬CA1區病理組織學觀察(HE染色，×400)

圖2 大鼠海馬透射電鏡觀察(×5000)

3 討論

癲癇是一種腦部神經元過度放電導致突然、反復、短暫的中樞神經系統功能失常的慢性病[10]，已成為神經系統疾病中僅次于腦卒中的第二大常見病[10]。癲癇患者伴隨學習記憶下降及認知障礙，可能與反復或長時間癇性發作致缺氧、乳酸酸中毒及神經遞質過度興奮，進而導致繼發性神經元代謝及結構損傷有關[11]。

靈芝的主要化學和藥效成分之一靈芝三萜可抑制神經細胞凋亡[12]，具有一定程度的抗癲癇作用[5]。外源性GM1也可抑制神經細胞凋亡[13-14]，通過調控腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)信號通路逆轉精神障礙引起的認知與記憶損傷[15-16]，提示兩藥可能對神經元的修復、再生存在協同效應。本項目組前期研究證實[17]，靈芝三萜化合物和GM1可以促進癲癇后神經再生與重塑，從而起到腦保護的作用。

表4 各組海馬Cofilin、SYN和GAP-43 mRNA表達比較

Morris水迷宮通過定位航行實驗和空間探索實驗可用來判斷動物對空間定位的學習記憶能力[18]。本研究顯示，癲癇模型大鼠學習記憶下降與Jiang等[19]用戊四氮點燃大鼠癲癇模型的結果一致。靈芝三萜和GM1均能改善癲癇大鼠的認知能力，特別是空間學習記憶能力；但未發現聯合用藥有更明顯的效果。

海馬是對學習記憶最重要的區域，海馬神經元的凋亡、壞死或突觸丟失都會導致認知功能特別是學習記憶能力障礙[20]。本研究顯示，靈芝三萜和GM1均能改善癲癇引起的神經細胞損傷。

神經元突觸的功能與結構可隨外界刺激或環境因素的影響發生明顯的可塑性變化，神經突觸的可塑性變化與癲癇后記憶損傷密切相關，是癲癇及癲癇后記憶認知障礙的病理學基礎。SYN作為突觸發生和突觸重塑的重要標志，在身體所有的神經末端廣泛表達，對神經生長、修復再生及突觸重塑有重要作用[21]。GAP-43是神經突觸可塑性功能因子，與突觸聯接建立以及突觸損傷修復的過程密切相關。SYN和GAP-43表達水平與學習記憶能力密切相關。張巖等[22]的研究發現，海馬中SYN和GAP-43 mRNA的表達量升高，可改善大鼠的空間學習記憶能力和認知功能障礙。Cofilin是重要的調節細胞骨架聚合與解聚的因子，參與神經損傷、修復再生過程[23]。Cofilin基因及蛋白水平上調可以破壞原有的正常神經網絡，阻礙胞內軸漿運輸，誘導海馬神經元突觸丟失，影響突觸可塑性[24]。在腦損傷防治策略中，可以通過下調Cofilin、上調GAP-43的表達，促進神經軸突再生，進而改善神經細胞損傷[25]。

本研究顯示，Cofilin蛋白聚集、SYN和GAP-43表達降低可能與癲癇大鼠空間學習記憶功能的損害有關，靈芝三萜和GM1及兩者聯合用藥可改善癲癇大鼠的空間學習記憶能力，可能與其下調Cofilin mRNA水平，促進SYN和GAP-43的mRNA表達，從而提高突觸修復及再生能力有關。作用機制還有待進一步研究。聯合用藥未發現更明顯的效果。