“三法三穴”推拿手法對坐骨神經損傷大鼠運動功能和轉化生長因子β1/Smad2通路蛋白表達的影響

邵帥，莫巖君，于天源，沈熠，羅宇婷，張羽墨，呂桃桃

北京中醫藥大學，北京市 100029

周圍神經損傷是指周圍神經叢、神經干或其分支受外力作用，如銳器傷、牽拉傷、擠壓傷等而發生的損傷，會造成受損神經支配區域運動和感覺功能的缺陷。推拿能夠有效促進周圍神經再生和感覺、運動功能恢復[1-3]。施萬細胞是周圍神經損傷和修復的主要參與者之一。周圍神經損傷后，遠端神經施萬細胞轉變為無髓表型并快速增殖，分泌趨化因子吸引巨噬細胞到達受損神經殘端，分泌細胞因子指導軸突再生。推拿能夠有效促進神經再生，但推拿對施萬細胞增殖的影響尚缺乏定量研究。

轉化生長因子β1 (transforming growth factor β1,TGF-β1)作為施萬細胞重要的細胞因子，在損傷早期能夠促進施萬細胞向無髓表型轉化，促進施萬細胞增殖，同時促進瘢痕形成。脈沖電磁場可通過促進TGF-β1表達以促進神經修復[4]，但推拿對TGF-β1表達的影響尚不清楚。本研究觀察“三法三穴”推拿手法對坐骨神經損傷(sciatic nerve injury,SNⅠ)大鼠后肢運動功能以及坐骨神經損傷點施萬細胞標志物S100、TGF-β1及其下游信號Smad2的表達，以闡釋SNⅠ大鼠運動功能恢復機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組

清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠66只，體質量(200±10) g，由北京斯倍福實驗動物中心提供。適應性飼養1周后，按隨機數字表隨機分為假手術組、模型組和觀察組，每組22只。本實驗已通過北京中醫藥大學針灸推拿學院動物實驗倫理委員會批準。實驗過程對動物的處置遵循科技部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》相關規定。

1.2 主要儀器與試劑

推拿手法模擬儀：中國專利號200710187403.1。CM 1950冰凍切片機：德國LEⅠCA公司。Nikon Eclipse 80i熒光顯微鏡：日本NⅠKON公司。電子天平：德國塞多利斯科學儀器有限公司。蛋白電泳電轉系統、Western blotting成像分析儀：美國BⅠO-RAD公司。SpectraMax M2酶標儀：美國MOLECULAR DEVⅠCES公司。TS-2000A搖床：中國KYLⅠN-BELL公司。

BCA蛋白濃度測定試劑、TBST、電泳緩沖液、電轉液：北京索萊寶生物科技有限公司。SDS-PAGE凝膠預混液、超敏化學發光試劑盒：蘇州新賽美生物技術有限公司。TGF-β1兔抗大鼠一抗、GAPDH兔抗大鼠一抗、Smad2兔抗大鼠一抗、S100小鼠抗大鼠一抗、山羊抗兔二抗、含DAPⅠ封片劑：美國ABCAM生物科技有限公司。山羊抗兔熒光二抗(綠色)、驢抗小鼠熒光二抗(紅色)：美國ⅠMMUNOWAY生物科技有限公司。

1.3 模型制備

對模型組和觀察組進行坐骨神經夾持手術[3]。1%戊巴比妥鈉3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，備皮消毒后暴露右側坐骨神經，用止血鉗于梨狀肌下緣5mm處滿扣夾持坐骨神經5s后縫合。術后每天固定時間觀察大鼠排便、排尿和進食情況。造模后大鼠右后肢癱瘓、蜷縮、跛行為坐骨神經夾持損傷模型造模成功的標準。假手術組僅分離后暴露坐骨神經5s，不夾持。

1.4 干預

假手術組和模型組不干預。觀察組于造模成功后第8天開始干預。在不影響傷口愈合的前提下，采用“三法三穴”推拿手法干預，即每天用推拿手法模擬儀依次在大鼠手術側殷門、承山、陽陵泉施行點、撥、揉法，刺激力量為5 N。每法每穴1 min，每只總計9 min。按摩頭為光滑的、直徑10mm的圓形接觸面。每天1次，共21d。

1.5 觀察指標

1.5.1 坐骨神經功能指數(sciatic functional index,SFⅠ)[4]

在干預前和干預21d，每組取6只大鼠，雙后足染色，放入鋪有打印紙的木槽，待大鼠行走留下3～4對足印。標記大鼠手術側足為E，正常側足為N。選擇印跡清晰的足印分別測量足印長度(print length,PL)、足趾寬度(toe spread,TS)、中間足趾距離(intertoes distance,ⅠT)。代入公式[5]。

1.5.2 斜板測試[6]

于干預前，干預7 d、14 d、21 d，每組取6只大鼠置于25°斜面上適應1 min；之后逐漸增加斜板的角度。當大鼠可在一定角度堅持5 s且不滑落，則繼續增加角度，直至無法在該斜板上堅持5 s。記錄大鼠所能堅持的最大角度。每只測量3次，取均值。

1.5.3 免疫熒光染色

干預21d，每組取4只大鼠，1%戊巴比妥鈉3.5ml/kg腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛溶液灌注固定后，取右側坐骨神經2cm于30%蔗糖水中脫水、OTC包埋、冰凍切片，厚度12μm。取部分切片，干燥，TBS緩沖液漂洗，封閉劑封閉1 h，加入TGF-β1兔抗大 鼠ⅠgG (1∶50)或Smad2兔抗大鼠ⅠgG (1∶500)、S100小鼠抗大鼠ⅠgG(1∶1000)，過3夜后，避光加入山羊抗兔ⅠgG (1∶1000，綠 色)，驢抗小鼠ⅠgG(1∶500，紅色)，過夜后漂洗，使用含DAPⅠ的封片劑封片，于顯微鏡下觀察損傷神經的形態結構。

采用Ⅰmage J圖像分析軟件，在每只大鼠的神經圖像中隨機選擇3個500×500的視野測定積分光密度(integrated optical density,ⅠOD)，取平均值；將TGF-β 1與S100共標，觀察TGF-β1的表達部位與施萬細胞的關系；將Smad2與DAPⅠ共標，觀察Smad2表達部位與細胞核的關系。

1.5.4 Western blotting

在干預前，干預7 d、21 d，每組取6只大鼠，1%戊巴比妥鈉3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，于冰上取損傷點處新鮮坐骨神經組織約2 cm，-80 ℃冰箱保存。取出坐骨神經標本置于研磨棒中，加入組織裂解液，于冰上裂解15min，4 ℃、離心半徑9.5cm、1000r/min離心15min后取上清液，BCA法測定樣本蛋白濃度。將樣品以每孔20μg蛋白為標準進行上樣，在10%SDSPAGE膠上以80 V電壓電泳至溴酚藍跑至膠板底部。4 ℃30 V電壓轉膜12h。室溫封閉條帶2 h，加入稀釋后的一抗(TGF-β1 1∶500、Smad2 1∶4000、p-Smad2 1∶500、GAPDH 1∶3000)于4 ℃冰箱內搖床孵育12 h。TBST洗滌3次，每次5min，加入稀釋后的二抗(1∶3000)于室溫孵育1 h后，TBST洗滌3次，每次5 min，ECL化學發光液曝光，Ⅰmage J圖像分析軟件分析目標條帶的ⅠOD。以目的蛋白與內參蛋白的比值為相對表達量。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 SFⅠ

干預前，模型組和觀察組術后右足不能著地，SFⅠ低于假手術組(P＜0.05)。干預21 d，觀察組SFⅠ高于模型組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組不同時間點SFI比較

2.2 斜板測試

各時間點，模型組和觀察組斜板測試角度均小于假手術組(P＜0.05)。干預21 d，觀察組斜板角度高于模型組(P＜0.05)。見表2。

2.3 免疫熒光染色

三組坐骨神經TGF-β1和Smad2表達均無顯著性差異(P＞0.05)。模型組坐骨神經S100表達明顯低于假手術組(P＜0.01)，觀察組高于模型組(P＜0.05)，且與假手術組比較無顯著性差異(P＞0.05)。見表3。

假手術組和觀察組髓鞘排列相較于模型組都更加致密有序。Smad2主要表達在細胞核周圍。TGF-β1與S100表達部位存在著較高程度的重合。見圖1、圖2。

2.4 Western blotting

2.4.1 TGF-β1

干預前和干預7d，模型組TGF-β1表達較假手術組升高(P＜0.05)。干預7 d，觀察組TGF-β1表達較模型組降低，但無顯著性差異(P＞0.05)。干預21d，三組TGF-β1表達無顯著性差異(P＞0.05)。見 表4、圖3。

2.4.2 Smad2

干預前和干預7d，模型組Smad2表達較假手術組升高(P＜0.05)。干預7d，觀察組Smad2表達較模型組降低，但無顯著性差異(P＞0.05)。干預21d，三組Smad2表達無顯著性差異(P＞0.05)。見 圖4、表5。

2.4.3 p-Smad2

干預前和干預7d，模型組p-Smad2表達較假手術組升高(P＜0.05)。干預7d，觀察組p-Smad2表達較模型組降低，但無顯著性差異(P＞0.05)。干預21d，三組p-Smad2表達無顯著性差異(P＞0.05)。見圖5、表6。

3 討論

周圍神經損傷根據受損程度分為Ⅰ～Ⅴ度5個級別，Ⅰ度僅為神經傳導障礙，Ⅴ度為神經干完全斷裂。目前臨床對于周圍神經損傷的治療方法主要包括手術療法[6]、針灸療法[7]、推拿療法[8]和電刺激療法[9]。其中推拿療法作為主要的非手術療法之一，適用于臨床最常見的Ⅲ度以內的周圍神經損傷，有著無創傷、無痛苦、不受醫療條件限制的優勢。多項臨床試驗表明，推拿治療周圍神經損傷療效顯著。董林林等[10]采用董氏推拿六法(揉法、點法、拿法)治療神經根型頸椎病，有效率達93.33%。錢俊輝等[11]采用羅氏推拿治療腰椎間盤突出癥，愈顯率達90%。

本研究采用坐骨神經擠壓損傷模型，模擬臨床常見的周圍神經卡壓損傷，屬于推拿治療適用的Ⅱ度損傷。治療點選用殷門、承山、陽陵泉三穴，分屬足太陽膀胱經和足少陽膽經所過。殷門位于坐骨神經干處，承山位于脛神經，陽陵泉位于腓總神經；殷門位于股二頭肌，承山位于腓腸肌，陽陵泉位于脛前肌。這三個穴位是能夠同時刺激穴位、神經和肌肉的最佳治療點。

表2 各組不同時間點斜板測試角度比較(°)

表3 干預21 d各組損傷點TGF-β1、Smad2和S100的表達(ⅠOD)

周圍神經損傷后，損傷的遠端神經發生Wallerian變性，軸突、髓鞘崩解脫失，遠端神經施萬細胞轉變為無髓表型并快速增殖；增殖的施萬細胞形成Bungner帶，并通過分泌多種神經營養因子引導軸突生長。王婷等[12]發現，Bungner帶數量在損傷后7～15 d到達高峰。當軸突生長進入Bungner帶后，施萬細胞向有髓表型轉化，最終形成髓鞘。

TGF-β 是由兩個分子量為12.5 kDa亞單位組成的二聚體，是一種可以調節多種細胞生長、分化等細胞因子。在哺乳動物中，TGF-β1最為普遍。TGF-β1在許多生物學行為中起關鍵作用，如炎癥和免疫反應、胚胎發育、傷口愈合、細胞外基質形成和重塑等[13]。TGF-β1在損傷神經中主要分布于施萬細胞和巨噬細胞[14-16]。施萬細胞膜表面存在與TGF-β1有高度親和力的受體TGF-βR。TGF-β1通過與TGF-βR結合發揮調節作用。

TGF-β1與TGF-βR結 合，Smad2磷酸化為p-Smad2，p-Smad2分子穿過核孔進入細胞核，在神經損傷早期發揮促增殖作用[17-18]。TGF-β1能促進體外純化施萬細胞增殖。Einheber等[19]發現，TGF-β1可促進純化的施萬細胞增殖。張平安[20]發現，過表達TGF-β1可以促進純化的施萬細胞分化和增殖。說明在損傷早期，TGF-β1主要發揮促施萬細胞增殖作用。

圖1 干預21 d各組坐骨神經損傷點Smad2表達(免疫熒光冰凍切片，×400)

圖2 干預21 d各組坐骨神經損傷點TGF-β1、S100表達(免疫熒光冰凍切片，×400)

圖3 各組神經損傷點TGF-β1蛋白表達(Western blotting)

Chen等[21]發現，外源性TGF-β1對慢性收縮損傷大鼠神經性疼痛具有鎮痛作用。Sulaiman等[22]發現，外源性TGF-β 與毛喉素合用能夠促進周圍神經慢性損傷后修復。裴媛媛等[23]發現，損傷早期給予外源性TGF-β1能夠促進SNⅠ大鼠坐骨神經修復。

表4 各組神經損傷點TGF-β1的蛋白表達(ⅠOD)

表5 各組神經損傷點Smad2的蛋白表達(ⅠOD)

圖4 各組大鼠神經損傷點Smad2蛋白表達(Western blotting)

圖5 各組神經損傷點p-Smad2蛋白表達(Western blotting)

表6 各組神經損傷點p-Smad2的蛋白表達(ⅠOD)

本研究發現推拿能改善SNⅠ大鼠后肢運動功能和精細動作，這與既往研究結果相吻合[24]。

本研究通過免疫熒光法對坐骨神經損傷點處施萬細胞標記物S100進行定量分析，發現“三法三穴”能夠通過促進施萬細胞增殖以促進髓鞘修復。郭汝寶[25]發現，推拿可以促進損傷神經施萬細胞的增殖和髓鞘再生。魯夢倩[26]發現，推拿可明顯促進SNⅠ大鼠坐骨神經纖維髓鞘的再生，并且能夠促進施萬細胞分泌軸突導向因子Netrin1、Slit2。崔旻珍[27]發現，推拿可促進施萬細胞分泌層黏連蛋白，降低髓鞘堿性蛋白，促進施萬細胞增殖，減少髓鞘脫落，從而加快神經髓鞘的修復進程。

本研究顯示，TGF-β1主要表達于坐骨神經纖維髓鞘，且Smad2主要在細胞核周圍表達。TGF-β1在損傷神經內表達量的變化趨勢也與既往研究結果相吻合。Kim等[28]對SNⅠ大鼠損傷神經近端和遠端TGF-β表達進行時相研究，發現遠端施萬細胞的TGF-β1在受傷后3 d增加，一直持續到損傷后28 d神經再生結束。在本研究中，在損傷后7d，模型組TGF-β1在神經損傷點的表達升高，損傷后28 d，模型組與假手術組無顯著性差異。觀察組坐骨神經損傷點TGF-β1/Smad2通路蛋白表達在干預后21d與模型組比較無顯著性差異，說明推拿的促髓鞘修復作用可能與TGF-β 1/Smad2通路無關。

Western blotting結果顯示，坐骨神經損傷點TGFβ1/Smad2通路的蛋白表達出現降低趨勢，這可能與神經瘢痕形成有關。周圍神經受損后，成纖維細胞活化增殖，產生大量的Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白，導致瘢痕形成，阻礙神經再生[29-31]。TGF-β1是瘢痕形成的主要影響因子，對神經瘢痕的形成有著促進作用[32-33]。純化的TGF-β1能夠調節與瘢痕形成相關的組織型纖溶酶原激活物(tissue plasminogen activator,tPA)和纖溶酶原激活物抑制劑1 (plasminogen activator inhibitor 1,PAⅠ-1)的表達[34]，而推拿干預也能調節坐骨神經損傷點中tPA和PAⅠ-1的含量[35]。還有研究表明[36-37]，機械刺激能夠通過影響TGF-β1的表達減輕膠原蛋白及瘢痕形成。據此推測，本實驗中TGF-β1出現下降趨勢是由于推拿能夠通過調節TGF-β1的分泌，影響瘢痕形成。

目前，推拿治療周圍神經損傷作用機理的研究主要圍繞促進神經再生，對于作為阻礙神經再生因素的研究相對偏少，且在周圍神經損傷后瘢痕形成方面尚無相關研究。因此在未來的研究中，除對神經瘢痕進行形態學觀察外，還可以從基因水平層面和轉錄水平進一步探究推拿干預對神經瘢痕形成的影響及機理。