大蒜素抑制成纖維細胞增殖及遷移

朱守雷，楊建東，蔡俊，張玉杰，田原

（揚州大學臨床醫學院/蘇北人民醫院 脊柱科，江蘇 揚州）

0 引言

腰椎硬膜外纖維化又稱為硬膜外瘢痕，多項研究已證實成纖維細胞增殖引起硬膜外瘢痕過度增生，最終造成椎板切除術后硬膜囊及神經根受壓而產生腰腿痛癥狀[1]。在預防硬膜外纖維化方面，國內外學者采用了許多方法，包括微創手術、藥物治療、新興生物材料等[2]，最近一些學者使用免疫抑制劑及抗腫瘤藥物來抑制成纖維細胞增殖從而預防硬膜外纖維化[3]。然而這些藥物具有不同程度的毒副作用，因此尋找一種能夠預防硬膜外纖維化且無明顯毒副作用的藥物具有重要的臨床意義。

大蒜素是一類含硫天然化合物，是大蒜的主要活性物質，化學名為烯丙基硫代亞磺酯丙酯，具有消炎、抗菌、降血糖、降血脂及抗癌等多種生物活性，而且有抗心臟、肝臟以及肺等器官組織纖維化作用，而對正常組織細胞毒性作用很小[4]。然而大蒜素是否具有預防硬膜外纖維化的作用卻鮮有報道，因此本實驗假設大蒜素可抑制硬膜外瘢痕來源的成纖維細胞增殖及遷移，為預防硬膜外瘢痕提供新思路。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑

大蒜素購自中國青島捷世康生物科技有限公司，人體硬膜外瘢痕來源的成纖維細胞購自中國科學院上海細胞典藏庫，DMEM 培養液、胎牛血清購自美國Gibco 公司，青霉素鏈霉素混合液、胰酶消化液購自中國碧云天生物科技研究所，PBS 購自美國Hyclone 公司，CCK-8 試劑盒購自日本Dojindo Laboratories 公司，AO/EB 試劑盒購自中國南京凱基生物科技發展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

在含有10% 胎牛血清、100 mg/L 鏈霉素和1×105U/L青霉素的DMEM 培養液并于37 ℃、5% CO2及飽和濕度下孵箱中培養成纖維細胞，隔日換液。

1.2.2 CCK-8 檢測細胞活力

待細胞生長至對數生長期，0.25%胰酶消化細胞，以細胞密度為1×105/mL 的成纖維細胞懸液接種于96 孔板，培養24 h 后分別加入濃度為0、12.5、25、50、100、200 和400 mg/L的大蒜素再培養24 h，加入CCK-8 試劑10 μL，在450 nm波長下測定OD 值。細胞存活率=（實驗孔OD 值- 空白孔OD 值）/（對照孔OD 值- 空白孔OD 值）×100%。繪制細胞存活率曲線，并計算藥物半數抑制率IC50 值。

1.2.3 倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡下觀察細胞形態

待細胞生長至對數生長期，根據1.2.2 研究結果，分別加入終濃度為0、25、50、100 mg/L 的大蒜素，培養24 h 后，顯微鏡下觀察細胞形態。用濃度為0.5 μg/μL 的AO/EB 染色液4 μL 加入到預觀察的細胞懸液100 μL 中，取10 μL 于載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 劃痕試驗檢測細胞遷移能力

將成纖維細胞按2×105/mL 鋪板于6 孔板中，細胞培養24 h 后用黃色吸頭于每孔沿線垂直劃3 道劃痕，PBS 清洗掉劃落的細胞，每孔依次加入大蒜素濃度分別為0、25、50、100 mg/L 無血清培養液2 mL，分別于0 h 及24 h 觀察拍照。用ImageJ 1.46 軟件計算遷移率。遷移率=（初始面積- 相應時間點的面積）/初始面積×100%。

1.2.5 統計學分析

數據通過SPSS 19.0 統計學軟件分析處理后，數據以均數±標準差）來表示，組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK 法，均以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 大蒜素對細胞活力的影響

不同濃度大蒜素處理成纖維細胞后，細胞活性被明顯抑制，隨著藥物濃度的增加，細胞的存活率也逐漸下降（表1、圖1），與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），IC50 值為57.35 mg/L。

表1 CCK-8 法檢測不同濃度大蒜素處理后細胞的存活率

表1 CCK-8 法檢測不同濃度大蒜素處理后細胞的存活率

注：*P＜0.05，與對照組比較。

組別 n OD 值 存活率對照組 6 0.970±0.028 1.000 12.5 mg/L 6 0.805±0.010 0.787±0.013*25 mg/L 6 0.714±0.021 0.670±0.027*50 mg/L 6 0.610±0.032 0.536±0.041*100 mg/L 6 0.508±0.020 0.405±0.025*200 mg/L 6 0.392±0.020 0.256±0.025*400 mg/L 6 0.268±0.032 0.096±0.041*

圖1 大蒜素對成纖維細胞活力的影響

2.2 大蒜素對成纖維細胞形態結構的影響

2.2.1 倒置相差顯微鏡觀察不同濃度大蒜素對成纖維細胞形態的影響

不同濃度大蒜素作用于成纖維細胞24 h 后，鏡下見對照組細胞呈梭形，大小均勻，輪廓清晰，核仁呈橢圓形，貼壁生長。隨著大蒜素濃度的增加，細胞體積變小，形態不規則，核固縮，呈現凋亡特征（圖2）。

圖2 倒置相差顯微鏡下不同濃度大蒜素作用于成纖維細胞24 h 后細胞形態觀察（100×）

2.2.2 熒光顯微鏡下觀察不同濃度大蒜素對成纖維細胞形態的影響

不同濃度大蒜素作用于成纖維細胞24 h 后，對照組細胞結構清晰，包膜完整，著均勻的綠色熒光。隨著藥物濃度增大，活細胞比例逐漸減少，部分細胞核染色質著橘紅色，并出現凋亡小體（圖3）。

圖3 熒光顯微鏡下（200×）不同濃度大蒜素作用于成纖維細胞24 h后AO/EB 染色

2.3 大蒜素對成纖維細胞遷移能力的影響

用0、25、50、100 mg/L 大 蒜 素 處 理 成 纖 維 細 胞，0 h 及24 h 細胞劃痕結果見圖4。細胞遷移率分別為（51.93±3.53）%、（40.68±2.05）%、（27.82±1.54）% 及（13.63±1.27）%。與對照組比較，隨著大蒜素濃度增加，細胞遷移率逐漸下降，差異有統計學意義（n=3，P＜0.05），見圖5。

圖4 不同濃度大蒜素對成纖維細胞的細胞劃痕試驗比較（40×）

圖5 不同濃度大蒜素處理成纖維細胞24 h 后細胞遷移率比較

3 討論

硬膜外瘢痕的形成是一個比較復雜的病理生理過程，實質是纖維結締組織增生來修復椎板切除造成的局部缺損，目前公認的硬膜外纖維化學說認為纖維環、后縱韌帶及腰骶區的過度纖維疤痕形成，是椎板和椎間盤切除術后腰腿痛的主要原因[5]。近年來微創手術技術雖然在不斷進步，但是椎板切除術后硬膜外瘢痕造成的手術效果不滿意仍然是困擾外 科醫師的一大難題。也有許多學者通過使用各種新興生物材料作為物理屏障來預防瘢痕對硬膜囊及神經根的擠壓，但這些置入的材料不僅本身就有可能對硬膜囊及神經根造成擠壓，而且有些材料不能被人體吸收，對異物可產生機械刺激[6]。隨著對硬膜外瘢痕的深入研究，一些學者通過動物體內外實驗發現抑制瘢痕中的成纖維細胞增殖、調節膠原代謝可有效預防硬膜外纖維化[7]。當前預防硬膜外瘢痕的藥物種類繁多，但這些藥物大部分具有不同程度的毒副作用而限制了在臨床上的廣泛使用。這促使我們探尋新的能抑制成纖維細胞過度增殖的藥物，以預防硬膜外瘢痕過度增生。

大蒜素發揮生物活性作用的主要成分為二烯丙三硫，具有促健康和低毒性的特點[4]。吳更等[8]發現大蒜素能濃度依賴性抑制人牙周膜成纖維細胞的增殖和蛋白合成來治療根尖周病；李少春[9]發現大蒜素能抑制心肌成纖維細胞增殖分化來預防心肌梗死后纖維化。但關于大蒜素在硬膜外瘢痕中的研究及應用甚少，本實驗通過選擇不同濃度的大蒜素處理成纖維細胞，探討大蒜素是否具有抑制成纖維細胞增殖及遷移的作用，為大蒜素預防硬膜外瘢痕提供理論依據。

本研究中，CCK-8 試驗結果發現不同濃度大蒜素處理細胞后，與對照組比較，實驗組OD 值明顯降低，并呈一定的藥物濃度依賴性（P＜0.05），這說明大蒜素能夠抑制成纖維細胞增殖。顯微鏡下，對照組細胞體積大小均勻呈梭形，輪廓清晰，細胞核呈規則的橢圓形；加入不同濃度大蒜素后，細胞體積變小，形態不規則，核仁收縮，部分細胞輪廓模糊或消失，隨著大蒜素濃度增加部分細胞呈點狀，不能貼壁生長。熒光顯微鏡下發現，隨著大蒜素濃度增加，部分細胞膜皺縮，胞漿減少，核固縮，出現凋亡小體等凋亡特征，且死細胞數量逐漸增多。劃痕試驗結果發現，與對照組比較，隨著大蒜素濃度的增加成纖維細胞遷移率逐漸降低（P＜0.05），說明大蒜素能有效抑制成纖維細胞遷移。

綜上所述，大蒜素具有抑制成纖維細胞增殖及遷移的作用。后期我們將進一步探討其分子生物學機制，為預防硬膜外瘢痕提供了理論基礎。