黃芪多糖體外對非接觸共培養HUVECs 細胞誘導SGC7901 細胞轉移的影響

唐有為，李燁婷

（重慶市腫瘤醫院藥學部，重慶 400030）

2018 年世界范圍內，胃癌患者的新增病例數是100 萬，由胃癌造成的死亡超過78 萬，發病率在所有癌癥中排名第五，死亡率排名第三，男性發病率是女性的2 倍，中國胃癌發病人數占全球40%［1］。目前，國內由于早期篩查的缺乏，胃癌發現時大多已經到了中晚期［2-3］，而對于中晚期胃癌患者，轉移是造成患者死亡的主要原因之一［4］，因此，抑制或延緩胃癌細胞轉移對延長和改善胃癌患者的生存期及生存質量具有重要的意義。胃癌轉移與上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）具有密切關系，后者可使上皮性腫瘤細胞獲得間質表型，增強腫瘤細胞的侵襲和轉移［5-6］。

在腫瘤組織中，腫瘤細胞和非腫瘤細胞之間相互協同，共同促進腫瘤發展［7］，非腫瘤細胞包括炎癥細胞［8］、血管內皮細胞等。在多個腫瘤中均發現，腫瘤細胞與血管內皮細胞之間的相互作用可通過誘導EMT 的發生促進腫瘤細胞的轉移［9-11］。研究表明，黃芪多糖（APS）可通過抑制腫瘤轉移和增殖，誘導腫瘤細胞凋亡和周期阻滯，抑制腫瘤的發生與發展［12］，但對血管內皮細胞誘導腫瘤轉移的影響尚未見報道。本研究將通過非接觸共培養人血管內皮細胞與胃癌細胞系SGC7901，探索黃芪多糖對正常人血管內皮細胞誘導的胃癌細胞轉移的作用及相關分子機制。

1 材料

1.1 細胞株 人胃癌細胞系SGC7901 細胞購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫；人臍靜脈內皮細胞HUVECs 購自美國ATCC 公司。

1.2 試劑與藥物 黃芪多糖（批號HQ090312，純度98%）購自陜西森弗生物技術有限公司。DMEM 高糖培養液購自美國Gibco 公司；FBS 購自北京四季青生物科技有限公司；胰蛋白酶、RIPA裂解液、超敏型ECL 檢測試劑、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液、SDSPAGE 電泳液、蛋白質印跡轉膜液均購自上海碧云天生物技術有限公司；MMP-2、MMP-9、LOX、Snail1 均為兔單克隆抗體，購自英國Abcam 公司；DyLight488 標記的山羊抗兔IgG 購自美國GeneTex公司；HRP 標記的山羊抗兔IgG 購買自美國CST公司；Trizol、逆轉錄試劑盒、實時定量PCR 試劑盒購買自寶日生物技術有限公司。

2 方法

2.1 細胞培養 SGC7901 細胞和HUVECs 細胞均加入含有10% FBS 的DMEM 高糖培養液，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞貼壁生長至80%～90%的融合度時傳代。

2.2 MTT 檢測 待細胞生長至對數期時，0.25%胰蛋白酶消化細胞并配制成細胞濃度1.5×105／mL 的單細胞懸液，以每孔100 μL 種植于96 孔板中，貼壁后加入黃芪多糖（2.5、5、10、20、40 mg／mL），并在對照組中加入相同體積的水，處理24、48、72 h，每孔加入20 μL MTT（5 mg／mL）培養4 h，棄去培養基，加入150 μL DMSO，酶標儀在490 nm處檢測每個孔的光密度（OD），計算抑制率。

2.3 共培養系統建立 將對數生長期的SGC7901細胞以1×106／mL 濃度接種于6 孔板中，每孔2.5 mL；在Transwell 共培養系統中，在上室中加入細胞濃度1×105／mL 的HUVECs 細胞1.5 mL，以含有10% FBS 的高糖DMEM 培養基作為單獨培養和共培養系統培養基培養48 h 后，收集下室SGC7901 細胞。SGC7901 組單獨培養SGC7901 細胞，HUVECs／ SGC7901 組按照上述共培養系統培養HUVECs／ SGC7901 細胞，黃芪多糖組在共培養HUVECs／ SGC7901 細胞系統的細胞中加入黃芪多糖（10 mg／mL）。每組重復3 次。

2.4 侵襲、遷移實驗 取對數生長期SGC7901 細胞1.5 mL，以濃度1×105／mL 接種于Matrigel 基質膠包埋的Transwell 小室的上室中，SGC7901 組下室中只加入含有10% FBS 的高糖DMEM 培養基，HUVECs／ SGC7901 組在下室中加入細胞濃度為1×105／mL HUVECs 細胞2.5 mL，黃芪多糖組在下室中加入細胞濃度為1×105／mL HUVECs 細胞2.5 mL和黃芪多糖（10 mg／mL）。各組細胞培養48 h 后，取出Transwell 小室，-20 ℃無水甲醇固定后PBS洗滌，棉簽輕輕拭去未侵襲過去的細胞，結晶紫染色3 min，PBS 洗滌后，每孔隨機選取5 個視野，拍照計數。除Tranwell 小室上室中不包埋Matrigel膠外，遷移實驗同侵襲實驗步驟一致。

2.5 qRT-PCR 檢測 經48 h 培養后，收集各組SGC7901 細胞，加入1.5 mL TRIzol，冰上吹打細胞，室溫靜置5 min，13 000 r／min 離心5 min，吸取上清，加入氯仿，靜置離心，吸取上清加入異丙醇，靜置離心，棄去上清，75%乙醇清洗沉淀，離心棄上清，保留沉淀干燥，用DEPC 水溶解。按照TaKaRa 反應試劑盒反轉錄成cDNA，對反轉錄產物進行擴增，PCR 反應條件為預變性95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，15 s；72 ℃，30 s，40 個循環。目的基因mRNA 相對表達量＝2-△△Ct，引物序列由TaKaRa 公司設計合成，E-鈣黏蛋白（E-Cadherin）正向5′-CCTACGATTTCCCATCACCA-3′，反向5′-GTCCACGGTCTCCTGTCTGT-3′；波形蛋白（Vimentin）正向5′-GGATTTCTCTGCCTCTTCCA-3′，反向5′-CACCTGTCCGTCTCTGGTTT-3′；β-actin正向5′-AGGGAAATCGTGCGTGACAT-3′，反向5′-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3′。

2.6 免疫熒光實驗 按“2.3”項下方法，細胞經48 h 培養后分組處理。取各組SGC7901 細胞，胰酶不消化直接在6 孔板中用PBS 洗滌，加入4%多聚甲醛，室溫固定15 min，PBS 漂洗，加入0.25% Triton 透膜15 min，加入用0.25% Triton 配制的5% BSA 封閉液封閉30 min，吸去封閉液，加入用封閉液配制的一抗，其中MMP-2、MMP-9 以1∶500 稀釋，4 ℃孵育過夜。PBS 洗滌后，加入以1∶2 000稀釋的Dylight488 標記的二抗，室溫孵育1 h，PBS 洗滌，熒光顯微鏡拍照，采用Image pro plus 軟件分析光密度值進行分析。

2.7 Western blot 實驗 按“2.3”項下方法，細胞經48 h 培養后分組處理。取各組SGC7901 細胞，PBS 洗滌后加入RIPA 裂解液在冰上裂解細胞，待細胞裂解后收集于離心管中，繼續裂解30 min，13 000 r／min 離心，收集上清，測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液，煮沸5 min，充分變性，-20 ℃保存備用。10%分離膠+5%濃縮膠，按蛋白濃度確定上樣量。經電泳、轉膜、封閉、一抗孵育過夜（其中LOX、Snail1 以及β-actin 均以1∶800 稀釋）、PBS 洗滌后，二抗（1∶2 000）室溫孵育1.5 h，PBS 洗滌，ECL 發光液顯色，X 光片顯影，拍照，Image pro plus 軟件分析光密度值。

2.8 統計學分析 采用SPSS 21.0 軟件進行處理，數據以（±s）表示，多組間比較采用多因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 黃芪多糖對SGC7901 和HUVECs 細胞的增殖影響 在同一時間下黃芪多糖對SGC7901 和HUVECs 細胞的增殖抑制率均隨其質量濃度的增大而升高；在同一質量濃度下，黃芪多糖對SGC7901和HUVECs 細胞的增殖抑制率均隨時間的增加而上升，具有濃度-時間依賴性。但SGC7901 和HUVECs 細胞對黃芪多糖的敏感性不同，黃芪多糖處理SGC7901 細胞24、48、72 h，IC50分別為19.04、10.07、5.39 mg／mL，而處理HUVECs 細胞分別為103.32、48.44、28.50 mg／mL。為保證后續實驗中黃芪多糖對SGC7901 細胞具有較好的干預作用，同時防止細胞毒性過大、干預時間過長或過短對實驗結果的干擾，選取48 h 和10 mg／mL 分別作為后續實驗的干預時間和干預質量濃度。見圖1。

圖1 黃芪多糖對SGC7901 細胞和HUVECs 細胞增殖的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of APS on SGC7901，HUVECs cell proliferation

3.2 黃芪多糖對SGC7901 細胞侵襲遷移的影響 與SGC7901 組相比，HUVECs／SGC7901 組SGC7901細胞侵襲遷移能力升高（P＜0.01）；與HUVECs／SGC7901 組相比，黃芪多糖組SGC7901 細胞侵襲遷移能力下降（P＜0.01）。見圖2。

3.3 黃芪多糖對SGC7901 細胞E-Cadherin、VimentinmRNA 表達的影響 與SGC7901 組相比，HUVECs／SGC7901 組SGC7901 細胞VimentinmRNA 表達升高（P＜0.01），E-cadherinmRNA 表達下降（P＜0.05）；與HUVECs／SGC7901 組相比，黃芪多糖組SGC7901 細胞VimentinmRNA 表達下降（P＜0.01），E-cadherinmRNA 表達升高（P＜0.05）。見圖3。

圖2 黃芪多糖對SGC7901 細胞侵襲遷移的影響Fig.2 Effects of APS on invasion and migration of SGC7901 cells

圖3 黃芪多糖對SGC7901 細胞E-Cadherin、Vimentin mRNA 表達的影響Fig.3 Effects of APS on E-Cadherin and Vimentin mRNA expression in SGC7901 cells

3.4 黃芪多糖對SGC7901 細胞MMP2、MMP9 蛋白表達的影響 與SGC7901 組相比，HUVECs／SGC7901 組SGC7901 細胞MMP-2、MMP-9 蛋白表達升高（P＜0.01）；與HUVECs／SGC7901 組相比，黃芪多糖組SGC7901 細胞MMP-2、MMP-9 蛋白表達下降（P＜0.01）。見圖4。

3.5 黃芪多糖對SGC7901 細胞LOX、Snail1 蛋白表達的影響 與SGC7901 組相比，HUVECs／SGC7901 組SGC7901 細胞LOX、Snail1 蛋白表達升高（P＜0.01）；與HUVECs／ SGC7901 組相比，黃芪多糖組SGC7901 細胞LOX、Snail1 蛋白表達下降（P＜0.01）。見圖5。

4 討論

圖4 黃芪多糖對SGC7901 細胞MMP2、MMP9 蛋白表達的影響Fig.4 Effects of APS on MMP2 and MMP9 protein expressions in SGC7901 cells

圖5 黃芪多糖對SGC7901 細胞LOX、Snail1 蛋白表達Fig.5 Effects of APS on the protein expressions of LOX and Snail1 in SGC7901 cells

上皮間質轉化（EMT）在腫瘤獲得較低分化程度和較高轉移的特性中至關重要，是腫瘤惡化的重要推動因素［13］，在網絡化的細胞調控中，EMT受到來自組織、細胞、分子以及環境等各個層面的調控；在細胞層面，腫瘤細胞與非腫瘤細胞之間的相互作用在調控腫瘤細胞EMT 中扮演重要作用。血管內皮細胞是襯于血管、淋巴管、心臟等內表面的單層扁平上皮細胞，并形成血管內壁，在腫瘤組織中，血管內皮細胞與腫瘤細胞存在著相互作用，促進腫瘤細胞EMT 轉化。研究［14］發現，在頭頸鱗狀癌細胞中血管內皮細胞分泌的VEGF、IGF 可通過VEGFR-2／HEF1／Akt／Twist1 通路促進腫瘤細胞EMT 轉化和轉移；本研究發現，與單獨培養的SGC7901 細胞相比，與HUVECs 細胞非接觸共培養的SGC7901 細胞的轉移能力顯著升高，提示HUVECs 細胞對SGC7901 細胞的轉移具有促進作用。進一步對SGC7901 細胞中EMT 相關分子的檢測發現，HUVECs 可促進SGC7901 細胞中MMP2、MMP9、Vimentin、Snail1 表達增加，抑制 Ecadherin 表達。在EMT 過程中，上皮細胞表型標志物E-cadherin、Cytokeratin 等表達缺失，導致細胞喪失極性和細胞間連接；間質細胞表型標志物MMPs、Vimentin、α-SMA 等表達上調，導致細胞形態易發生變化，同時對胞外基質的降解能力增加，以上因子的綜合變化在腫瘤中導致細胞發生EMT，促進腫瘤轉移。轉錄因子Snail 可調控EMT。激活的Snail 識別并結合到E-cadherin 基因上的Ebox 序列，抑制E-cadherin 的基因表達，進而促進細胞的EMT。綜上所述，HUVECs 細胞可促進SGC7901 細胞的EMT 轉化，誘導SGC7901 細胞轉移；給予黃芪多糖干預后，共培養SGC7901 細胞的轉移能力，以及細胞中表達上調的MMP2、MMP9、Vimentin、Snail1 和表達下調的E-cadherin均發生回調，提示黃芪多糖可抑制HUVECs 誘導的SGC7901 細胞的EMT 轉化。

目前，對腫瘤轉移的抑制可顯著延長患者的總體生存時間，降低3 年復發率［15-16］。EMT 的激活可受多條通路和多個因子影響，多項研究發現Notch 信號通路、STATs 信號通路［17］、Hedgehog 信號通路［18-19］均與胃癌的EMT 密切相關。由于EMT是細胞逆分化獲得間質細胞特性的過程，因此其激活與多個與胚胎發育相關的信號通路的激活尤為密切，包括Wnt 信號通路［20］、Hedgehog 信號通路［21］、TGF-β／Smads 信號通路［22］。Snail 作為轉錄因子，可直接通過作用于靶基因調控EMT 過程中相關蛋白的表達，特別是Snail1 和Snail2，可通過進入細胞核識別靶向序列上的E-Box 序列，其中E-cadherin 基因上存在E-Box 序列，Snail 與E-Box序列的結合抑制了E-cadherin 的表達，促進Vimentin的表達，進而啟動了EMT 過程［23］，同時已證明LOX 可穩定Snail1 蛋白［24］。本研究發現，與血管內皮細胞的共培養可促進SGC7901 細胞中LOX 和Snail1 蛋白表達上升，但給予APS 干預后這種促進作用被抑制，同時共培養SGC7901 細胞中LOX 和Snail1 蛋白顯著下降，證實APS 可通過抑制HUVECs 誘導的SGC7901 細胞LOX 和Snail1蛋白的表達，阻止SGC7901 細胞發生EMT。

綜上所述，HUVECs 細胞可促進胃癌細胞系SGC7901 細胞轉移，可能是通過HUVECs 誘導SGC7901 細胞EMT 的激活實現的，而黃芪多糖可抑制HUVECs 對SGC7901 細胞的這種誘導作用，但具體是通過哪種信號通路還需作進一步研究。